产品信息

产品简介

SpCas9 来源于 S. pyogenes 菌株，是依赖于 crRNA 和 tracrRNA(或连接后形成的 sgRNA)引导的 DNA内切核酸酶，在靶标双链 DNA 存在 PAM(NGG)的情况下，特异地切割靶标双链 DNA，使 DNA 双链断裂并生成平末端。PAM 对于 SpCas9 的识别和切割都是必需的，其切割位点位于目标序列(target sequence)内，离 PAM 区 3 个碱基。SpCas9 酶的 HNH 和 RuvC 结构域分别负责切割靶标双链 DNA 中与 sgRNA 配对和非配对的链。本产品中，SpCas9 的 H840 和 D10 都被突变为 A，从而使其 HNH 和 RuvC 功能域失活，获得了 Sp-dCas9 酶。因此，Sp-dCas9 只有结合靶标 DNA 的活性，而没有切割靶标 DNA 的活性。

产品组分

a. Sp-dCas9 Nuclease 浓度为 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 规格的总体积为 10 μL，1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL； 

保存条件

-20℃储存；≤ 0℃运输。

实验流程

1. Sp-dCas9 与靶标 DNA 结合实验

37℃反应 30 min，可通过非变性核酸电泳对实验结果进行检测。

实验结果

为了验证 Sp-dCas9 与 target DNA 的结合，我们通过 5′端带 FAM 基团的引物在全长 59 bp 的 targetdsDNA 末端加上 FAM 标记。在 20 μL 反应体系中加入 2 μL的 10 × TOLO Buffer 3, 1.5 μL 的 10 μM Sp-dCas9Nuclease, 1.5 μL 的 10 μM sgRNA, 和 3 μL 的 1 μM target dsDNA-FAM, 然后将结合反应体系在 37℃静置孵育 30 min，用 2%的琼脂糖凝胶低温电泳 100 V，60 min 后，在化学发光成像分析仪(GE ImageQuantLAS4000)上用荧光通道检测样本条带。实验结果表明，Sp-dCas9 + sgRNA + target dsDNA-FAM 泳道电泳跑胶迁移速率较慢，说明 Sp-dCas9 在 sgRNA 的引导下特异地识别并结合了 target dsDNA。此外，还可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)对 Sp-dCas9 与 target DNA 的结合进行检测。

注意事项

1. 为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。

2. 因反应需添加 RNA(sgRNA 或者 crRNA:tracrRNA)，整个体系，包括 Sp-dCas9 酶都必须不含任何其它核酸酶活性。本产品经过严格质控，无任何其它核酸酶污染。

3. 反应结束后，可以采用非变性聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶电泳的方式来检测 Sp-dCas9 是否结合靶标双链 DNA。电泳缓冲液体系可使用 DEPC 处理以消除 RNase 的影响；同时，应保持低温下电泳，相关要求可参考 RNA EMSA 体系。

4. Sp-dCas9 酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，使用后立即置于-20℃保存。

5. 本产品仅供科研使用。若进行商业用途，需联系专利持有方获取相关的专利授权。