产品信息

产品简介

SpCas9来源于S.pyogenes菌株，是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶，在靶标双链DNA存在PAM(NGG)的情况下，特异地切割靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于SpCas9的识别和切割都是必需的，其切割位点位于目标序列(target sequence)内，离PAM区3个碱基。SpCas9酶的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标双链DNA中与sgRNA配对和非配对的链。本产品中，SpCas9的H840被突变为A，从而使其HNH结构域失活。因此，SpCas9 H840A Nickase只有RuvC结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的NTS链，形成单链切刻。

产品组分

a:SpCas9 H840A Nickas为10uM，即10pmol/ul, 100pmo规格l的总体积为10ul,1000pmo规格l的总体积为100ul.

实验案例

1.SpCas9 H840A Nickase对超螺旋DNA靶标的切刻实验:为了验证SpCas9 H840A Nickase可以剪切特异靶标dsDNA中的NTS链并产生单链切口，我们使用带有靶位点的超螺旋DNA(cccDNA)作为剪切底物，将SpCas9 H84OA Nickase、sgRNA和target cccDNA加入剪切反应体系，在37℃静置孵育30 min，然后85℃灭活5 min。切刻后的开环DNA(ocDNA)较原始的cccDNA迁移速率减慢，因此，可以用1%的琼脂糖凝胶电泳(150V，20 min)检测样本条带。实验结果表明，SpCas9 H840A Nickase可在sgRNA引导下使target cccDNA产生单链切刻。

设计SpCas9 H840A Nickase的sgRNA

SpCas9 H840A Nickase的sgRNA可参照以下序列设计(PMID:26545076):

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAU

CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3’，(下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。