环孢子虫是一种可感染人体的寄生原虫，主要通过被污染的水源、生食果蔬传播，引发环孢子虫病，典型症状为水样腹泻、腹痛、乏力、食欲减退，病程常迁延数周。诊断多依靠粪便检查卵囊或PCR核酸检测，日常预防以注意饮食饮水卫生、彻底清洗果蔬为主。

本文提出了一种名为‌RECCT-Cay‌ 的现场即时检测平台，用于检测人粪便中的‌环孢子虫‌。该方法结合了‌重组酶聚合酶扩增‌ 和‌CRISPR/Cas12a‌ 系统，旨在解决传统检测方法在偏远地区或现场应用中的局限性。

‌一、研究背景与目标‌

·‌问题：‌ 环孢子虫是一种通过食源性和水源性传播的新兴肠道致病性原虫，在全球多地引起疾病爆发。目前常用的显微镜检查和PCR检测方法存在操作繁琐、耗时、需要专业实验室和人员、或灵敏度/特异性不足等问题，不适合现场即时检测。

·‌目标：‌ 开发一种‌快速、灵敏、特异且适用于现场‌的POCT检测方法，用于环孢子虫的快速诊断。

‌二、研究方法与技术原理‌

1.‌技术平台：‌ 建立了‌RECCT-Cay‌ 检测平台。

o‌第一步：‌ 使用‌RPA‌ 在恒温（37°C）下快速扩增目标DNA（选择环孢子虫线粒体基因组中的 ‌Cox3 基因‌ 作为靶点）。

o‌第二步：‌ 利用‌CRISPR/Cas12a‌ 系统进行检测。当Cas12a蛋白在crRNA引导下识别并切割目标DNA后，会激活其非特异性切割活性，进而切割带有荧光基团-淬灭基团或FAM-生物素标记的报告分子。

2.‌结果判读：‌ 可通过两种方式直观读取结果：

o‌荧光检测：‌ 在蓝光仪器下肉眼观察荧光信号。

o‌侧向流动试纸条：‌ 通过试纸条上检测线是否显色进行判断。

3.‌配套开发：‌ 设计并开发了一个‌便携式手提箱‌，集成了从样本采集、快速粪便DNA提取到RECCT-Cay检测所需的全部试剂（包括冻干试剂）和最小化设备，实现了“一站式”现场检测。

其中，使用了沃博生物的产品，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301。

三、主要研究结果‌

1.‌高灵敏度：‌

o对纯化DNA的检测限低至 ‌7 拷贝/微升‌。

o在模拟临床条件下（粪便样本），检测限为‌每克粪便30个卵囊‌。

2.‌高特异性：‌ 该方法能有效区分环孢子虫与其亲缘关系密切的艾美耳球虫属物种，以及与其它常见肠道原虫（如刚地弓形虫、微小隐孢子虫等），无交叉反应。

3.‌临床验证：‌ 对30份临床粪便样本进行检测，其结果与巢式PCR检测结果完全一致（3份阳性，27份阴性），证明了该平台的临床适用性。

4.‌快速简便：‌ 整个检测过程可在约1小时内完成，且操作简单，无需复杂仪器和专业技术人员。

RECCT-Cay平台有哪些优势？

‌1. 快速高效‌

·整个检测过程（从样本处理到结果判读）可在‌约1小时内‌完成，远快于传统的PCR方法。

·采用‌恒温扩增（RPA）‌，无需复杂的温度循环设备，简化了操作流程。

‌2. 高灵敏度与高特异性‌

·‌灵敏度高‌：对纯化DNA的检测限低至‌7拷贝/微升‌；在模拟临床粪便样本中，检测限为‌每克粪便30个卵囊‌。

·‌特异性强‌：能够有效区分环孢子虫（Cyclospora cayetanensis）与其亲缘关系密切的艾美耳球虫属（Eimeria spp.）物种，以及其他常见肠道原虫（如弓形虫、隐孢子虫等），无交叉反应。

‌3. 适用于现场即时检测（POCT）‌

·‌设备要求低‌：核心反应在恒温（如37°C，可利用体温）下进行，无需昂贵的精密仪器（如PCR仪）。

·‌结果可视化，操作简便‌：

o可通过‌便携式蓝光仪器‌肉眼观察荧光信号。

o可使用‌侧向流动试纸条‌进行结果判读，无需专业技术人员。

·‌集成化便携设计‌：研究配套开发了一个‌便携式手提箱‌，集成了从样本采集、快速DNA提取到检测所需的全部冻干试剂和最小化设备（如移液器、恒温金属浴），实现了“一站式”现场检测。

‌4. 技术先进性与可靠性‌

·‌技术组合创新‌：首次将‌RPA恒温扩增‌与高特异性的‌CRISPR/Cas12a‌系统结合用于环孢子虫检测。

·‌临床验证一致‌：对30份临床粪便样本的检测结果与巢式PCR结果完全一致，证明了其临床应用的可靠性。

‌四、局限性‌

1.RPA试剂成本相对较高。

2.目前采用RPA与CRISPR/Cas12a分步反应，开管步骤有气溶胶污染风险，未来可优化为单管反应。

3.粪便基因组DNA的快速提取效率仍有提升空间。

‌五、结论与意义‌

本研究首次成功将RPA与CRISPR/Cas12a技术结合，应用于环孢子虫的检测。所构建的 ‌RECCT-Cay平台‌具有‌快速、高灵敏度、高特异性、设备要求低、结果可视化的优点‌。配合开发的便携式手提箱，该技术特别适用于‌诊所、偏远地区或现场环境‌下环孢子虫的初步筛查和诊断，为未来POCT技术的发展提供了重要参考。

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