一、实验目的

建立以尼帕病毒（NiV）RNA为直接模板的逆转录-重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）等温检测方法，规避传统RT-PCR对高精度温控设备的依赖，实现对临床样本中NiV RNA的特异性、快速扩增与定性检测。核心目标：检测周期≤30分钟，最低检测限（LOD）≤10³ copies/μL，特异性无交叉反应，操作流程简化，适配现场应急筛查与基层实验室应用。

二、实验原理

RT-RPA技术整合逆转录酶与RPA扩增体系，在37-42℃恒温条件下完成“RNA逆转录→cDNA扩增”一体化反应：逆转录酶首先将NiV RNA模板转化为cDNA；随后重组酶与特异性引物结合，扫描cDNA模板并定位同源序列，解开双链后引物与模板特异性结合；单链结合蛋白（SSB）保护单链DNA避免复性，链置换聚合酶以引物为起点延伸，形成新的双链DNA并置换出单链，该单链可作为新模板启动循环扩增，短时间内实现靶标核酸指数级增长。通过设计NiV保守基因（优先选择核蛋白N基因或RNA依赖的RNA聚合酶L基因）特异性引物与探针，结合荧光信号释放或侧向流层析（LFA）可视化技术，实现NiV RNA的快速定性。

三、实验材料与仪器

（一）实验材料

1.样本类型：临床疑似病例血清、鼻咽拭子洗脱液、脑脊液（经伦理审批与生物安全备案）；NiV RNA标准品（已知浓度的重组NiV N基因RNA，浓度梯度10⁸-10¹ copies/μL）；阴性对照样本（健康人血清RNA、无NiV的Vero细胞总RNA）；干扰病毒RNA样本（亨德拉病毒HeV、流感病毒H1N1、呼吸道合胞病毒RSV、副流感病毒PIV等，用于特异性验证）。

2.核心试剂：

◦RT-RPA扩增试剂：RT-RPA预混液（含重组酶、SSB、链置换聚合酶、dNTPs、逆转录酶）、荧光探针型RT-RPA试剂盒（探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，中间插入THF位点）、LFA型RT-RPA试剂盒（生物素标记上游引物、荧光素标记探针）、无酶纯水（RNase/DNase free）、启动液（280 mM MgAc）。

◦引物与探针设计：针对NiV N基因保守区域（GenBank登录号：NC_002728.1）设计特异性引物与探针，引物长度18-22 bp，探针长度25-30 bp，避免引物二聚体与非特异性结合（序列经NCBI BLAST验证，确保不与其他病毒及人源基因同源）。示例序列（参考优化）：

▪上游引物（F）：5’-GCTGCTGTTGCTGCTGTTGCT-3’

▪下游引物（R）：5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAA-3’

▪荧光探针（P）：5’-FAM-AGCAGCAGCAGCAGCAGCTHFAGCAGCAG-BHQ1-3’

◦RNA提取试剂：病毒RNA提取试剂盒（磁珠法或柱式法，含RNase抑制剂，兼容复杂样本）、裂解液（含异硫氰酸胍，抑制RNase活性）、洗涤液、洗脱液（含RNase抑制剂）。

◦辅助试剂：RNase抑制剂（40 U/μL）、阳性对照（NiV N基因RNA，10⁵ copies/μL）、阴性对照（无酶纯水）、LFA检测缓冲液、2%琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、无毒核酸染料。

（二）实验仪器

恒温金属浴（精度±0.5℃，可稳定设置39℃）、荧光定量RPA检测仪（或实时荧光定量PCR仪，兼容恒温模式）、侧向流层析读数仪（或肉眼观察）、全自动核酸提取仪（或手动提取离心管）、高速离心机（12000 rpm）、移液器（1 μL、10 μL、20 μL、100 μL，配套RNase free吸头）、超净工作台、二级及以上生物安全柜、-80℃冰箱（保存RNA样本）、涡旋振荡器、凝胶成像系统（可选，用于电泳验证）。

四、实验步骤

（一）RNA样本提取与保存

3.样本预处理：临床样本在生物安全柜内操作，血清样本室温静置30分钟后，12000 rpm离心5分钟取上清；鼻咽拭子洗脱液直接取样；脑脊液样本无需离心，直接使用。所有样本处理过程避免RNase污染，操作工具均经RNase free处理。

4.RNA提取：采用病毒RNA提取试剂盒，严格按照说明书操作，关键步骤如下：

◦取200 μL样本上清至RNase free离心管，加入5 μL RNase抑制剂与200 μL裂解液，涡旋混匀，室温静置5分钟（无需加热，避免RNA降解）。

◦加入200 μL无水乙醇，混匀后转移至吸附柱，12000 rpm离心1分钟，弃废液。

◦依次加入500 μL洗涤液Ⅰ、500 μL洗涤液Ⅱ，每次离心1分钟，弃废液。

◦空柱12000 rpm离心2分钟，去除残留洗涤液（避免抑制RT-RPA反应）。

◦向吸附柱中央加入50 μL洗脱液（含RNase抑制剂），室温静置2分钟，12000 rpm离心2分钟，收集洗脱液（含NiV RNA），立即用于实验或-80℃密封保存（避免反复冻融）。

（二）RT-RPA反应体系配制

5.反应体系设计（总容积50 μL，RNase free环境操作）：

◦RT-RPA预混液 25 μL

◦上游引物（10 μM） 2.5 μL

◦下游引物（10 μM） 2.5 μL

◦荧光探针（5 μM） 1 μL

◦模板RNA 5 μL（提取的病毒RNA或标准品，含RNase抑制剂）

◦无酶纯水 13 μL

◦启动液（280 mM MgAc） 1 μL（最后加入启动反应）

6.配制流程：

◦在超净工作台内，按上述顺序依次加入RT-RPA预混液、引物、探针、模板RNA与无酶纯水，涡旋混匀（避免气泡产生），短暂离心（5000 rpm，10秒）使液体集中于管底。

◦最后加入启动液MgAc，迅速轻轻混匀（避免剧烈震荡导致RNA降解），立即离心（5000 rpm，10秒），放入预热至39℃的恒温金属浴或荧光定量检测仪中。

（三）RT-RPA等温扩增

7.反应条件：恒温39℃（优化后最佳反应温度，兼顾逆转录效率与RPA扩增活性），反应时间25分钟（荧光检测实时监测，LFA法反应20分钟即可终止）。

8.荧光信号采集：若使用荧光定量RPA检测仪，设置激发波长485 nm、发射波长520 nm，每30秒采集一次荧光信号，记录荧光增长曲线；若使用普通恒温金属浴，反应结束后立即进行后续检测，避免扩增产物降解。

（四）结果检测与判定

1. 荧光定量检测法（推荐，灵敏度高，适合实验室精准检测）

•阳性结果：检测到明显的荧光增长曲线，且Ct值（荧光信号达到阈值的反应时间）≤25分钟；

•阴性结果：未检测到荧光增长曲线，或Ct值＞28分钟；

•临界结果：Ct值在25-28分钟之间，需重新提取RNA样本复检，复检仍为临界值则判定为可疑，结合临床症状与RT-PCR金标准确认。

2. 侧向流层析（LFA）检测法（可视化，适合现场快速筛查）

•反应结束后，取10 μL RT-RPA扩增产物滴加至LFA试纸条样品孔中，加入20 μL LFA检测缓冲液，室温静置5-8分钟；

•阳性结果：试纸条同时出现质控线（C线）与检测线（T线），表明扩增产物中存在NiV靶核酸；

•阴性结果：仅出现C线，无T线；

•无效结果：C线未出现，表明试纸条失效或操作污染，需更换试纸条重新检测。

3. 琼脂糖凝胶电泳验证（可选，用于方法学验证）

•制备2%琼脂糖凝胶（含无毒核酸染料），取10 μL RT-RPA扩增产物与2 μL Loading Buffer混匀，点样至凝胶孔中；

•以120 V电压电泳20分钟，凝胶成像系统观察结果；

•阳性结果：出现与预期大小（如180 bp，根据引物设计确定）一致的特异性条带；阴性结果：无特异性条带。

（五）质量控制

9.阳性对照：以NiV RNA标准品为模板，应检测出阳性结果（荧光曲线、LFA双条带或电泳特异性条带），否则实验无效；

10.阴性对照：以无酶纯水为模板，应检测出阴性结果，若出现阳性信号，表明存在RNA污染或试剂污染，需更换试剂重新实验；

11.样本重复：每个样本设置2个平行重复孔，至少1个重复孔出现阳性结果且无明显污染，方可判定为阳性；

12.RNA保护：全程使用RNase free耗材与试剂，实验台面用RNase清除剂擦拭消毒，避免RNA降解导致假阴性。

五、方法学验证

（一）特异性验证

13.用建立的RT-RPA方法检测NiV RNA标准品、干扰病毒RNA（HeV、H1N1、RSV等）、健康人血清RNA；

14.仅NiV RNA标准品出现阳性结果，其他干扰样本均为阴性，表明方法特异性良好（无交叉反应）。

（二）灵敏度验证

15.将NiV RNA标准品进行10倍梯度稀释（10⁸-10¹ copies/μL），每个浓度设置3个重复孔；

16.用RT-RPA方法检测各浓度标准品，记录最低检测限（LOD），要求LOD≤10³ copies/μL，满足临床样本低浓度病毒检测需求。

（三）重复性验证

17.选取高、中、低3个浓度的NiV RNA标准品（10⁶、10⁴、10³ copies/μL），每个浓度进行3次独立实验，每次实验设置2个平行孔；

18.计算批内与批间变异系数（CV），要求CV≤6%（RNA样本易降解，CV阈值略高于DNA检测），表明方法重复性良好。

（四）临床样本验证

19.收集经RT-PCR金标准确诊的NiV阳性样本、疑似样本及健康人样本各25份，提取RNA后用本方法检测；

20.计算灵敏度（真阳性率）、特异性（真阴性率）、符合率，要求灵敏度≥94%，特异性≥98%，符合率≥96%。

六、生物安全与注意事项

21.尼帕病毒为一类高致病性病毒，所有样本处理、RNA提取及扩增产物处理均需在二级及以上生物安全柜内进行，实验人员穿戴全套个人防护装备（防护服、N95口罩、手套、护目镜）；

22.实验废弃物（样本、离心管、吸头、扩增产物）需经高压蒸汽灭菌（121℃，30分钟）或含氯消毒剂（有效氯5000 mg/L）浸泡30分钟后，按医疗废弃物规范处理；

23.反应条件控制：恒温金属浴温度偏差≤±0.5℃，温度过高会导致酶活性丧失，过低则降低扩增效率；启动液MgAc需最后加入，避免提前启动反应；

24.RNA降解防控：提取的RNA样本避免长时间室温放置，若不立即使用，需-80℃密封保存，反复冻融不超过3次；

25.试剂保存：RT-RPA预混液、引物、探针需-20℃避光保存，解冻后在冰上操作，2小时内用完；RNase抑制剂需-20℃单独保存，避免与其他试剂混放。

七、实验结果记录与报告

26.详细记录实验日期、样本信息（编号、类型、来源）、试剂批号、仪器参数（温度、时间）、每个样本的检测结果（荧光Ct值、LFA条带情况、电泳条带大小）；

27.方法学验证结果需记录特异性、灵敏度、重复性数据，绘制灵敏度梯度稀释荧光曲线与特异性验证电泳图；

28.临床样本检测报告需明确样本编号、检测方法（NiV RNA RT-RPA等温扩增法）、检测结果（阳性/阴性/可疑）、结果解释及建议（如可疑样本需复检、结合临床症状诊断），报告需经实验人员与审核人员签字确认。

八、实验周期

单批次样本（20份）检测周期：RNA提取（40分钟）+ RT-RPA反应与检测（30分钟）+ 结果分析（10分钟），总周期≤1.5小时，满足快速筛查需求。

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