OTSRC——一种硒增强的单管重组酶聚合酶扩增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a检测平台
宫颈癌作为女性系统高发恶性肿瘤，其防控意义远超疾病本身。重庆大学、四川大学等机构的研究团队开发了一种硒增强的单管重组酶聚合酶扩增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a检测平台，命名为<span style="text-indent: 2em;" data-pm-slice="1 1 ["para",{"tagName":"section","attributes":{},"namespaceURI":""}]">OTSRC，用于人乳头瘤病毒16型（HPV 16）DNA的超灵敏、低背景噪声检测。该平台旨在解决传统等温扩增中存在的非特异性扩增问题，为宫颈癌筛查提供一种快速、高灵敏、高特异性的即时检测（POCT）方案。
1.靶标基因：针对HPV 16型高度保守的 L1基因的部分序列进行检测。
在传统的RPA反应体系中，掺入10%的硒修饰核苷酸三磷酸（dNTPαSe），替代部分普通dNTPs。
o抑制非特异性扩增：dNTPαSe能竞争性抑制普通dNTPs的掺入，有效抑制引物非依赖的DNA从头合成，从而降低背景噪声。
o提高保真度：硒原子较大的原子半径降低了DNA双链的热稳定性，并降低了DNA聚合酶的结合亲和力。这为聚合酶提供了更长的“校对”时间，使其能更有效地识别并纠正错配的引物和错误掺入的核苷酸，从而提高扩增的准确性和特异性。
采用创新的单管物理分隔设计：将Se-RPA反应体系置于管盖，CRISPR/Cas12a检测体系置于管底。
第一步（37°C, 10分钟）：进行Se-RPA扩增，生成硒修饰的双链DNA（dsDNA）产物。
第二步（离心混合）：通过离心将管盖的RPA扩增产物转移至管底，与CRISPR体系混合。
第三步（37°C, 10分钟）：扩增产物激活Cas12a的反式切割活性，切割荧光报告探针（FAM标记），释放荧光信号。
优势：该设计实现了真正的单管封闭反应，极大降低了气溶胶污染风险，简化了操作。
其中，使用了沃博生物（warbio）的产品，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301。
1.体系构建与验证：首先构建了传统的两步法RPA-CRISPR（TSRC）和单管RPA-CRISPR（OTRC）体系作为对比。通过荧光强度和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了OTSRC体系的可行性，证明dNTPαSe的加入能显著降低背景信号（OTSRC的背景信号仅为OTRC的71.77%），同时产生硒修饰的扩增产物。
dNTP浓度：确定20 μM为OTRC体系中的最佳dNTP浓度。
dNTPαSe比例：确定10% 为OTSRC体系中dNTPαSe的最佳体积百分比。
反应温度与时间：优化后确定Se-RPA和CRISPR反应均在37°C下进行10分钟，总反应时间约20分钟。
1.灵敏度：
OTSRC：检测限（LOD）低至 169 aM（阿摩尔，约10⁻¹⁸ 摩尔），线性范围为100 aM 至 1 μM。
OTRC：检测限为340 aM，线性范围为1 fM 至 100 nM。
结论：OTSRC的灵敏度是OTRC的两倍，且与金标准方法实时荧光定量PCR（qPCR） 的检测效果相当（qPCR检测限为100 aM）。
结论：OTSRC的视觉检测灵敏度比OTRC高一个数量级。可视化检测的灵敏度比荧光检测低4-5个数量级，主要归因于固相输出端的信号损失。
OTSRC与OTRC结合侧流层析试纸条（LFA）检测10 fM ~ 10 μM HPV DNA
2.特异性：使用四种非特异性DNA序列（浓度100 nM）进行测试。结果显示，仅HPV 16 DNA能产生高荧光信号，其他DNA的信号与背景无差异。LFA测试也显示仅HPV DNA能在检测线（T线）产生红色条带。证明了OTSRC和OTRC均具有优异的选择性。
荧光检测：OTSRC和OTRC的重复性实验相对标准偏差（RSD）分别为 4.589% 和3.793%，表明重复性良好。
LFA检测：多次测试结果一致，显示良好的再现性。
4.实际样本检测（抗干扰能力）：将HPV 16 DNA加入20倍稀释的人血清中进行加标回收实验。
OTSRC：回收率在81.28% 至 107.1% 之间，RSD在 1.087% 至 3.457% 之间。
OTRC：回收率在94.91% 至 134.9% 之间，RSD在 1.350% 至 4.732% 之间。
结论：OTSRC在复杂生物基质中表现出更优的准确度和精密度，具备临床检测潜力。
1.超低背景噪声与高灵敏度：通过引入dNTPαSe，首创性地将硒化学修饰与RPA-CRISPR系统结合，显著抑制了非特异性扩增，将检测背景噪声降低至传统体系的71.77%，并将灵敏度提升了一倍。
2.高保真度与特异性：dNTPαSe增强了DNA聚合酶的“校对”能力，结合CRISPR/Cas12a序列特异性识别的双重验证机制，确保了检测的极高准确性。
3.快速单管封闭式操作：整个检测流程仅需约20分钟，且在恒温37°C下完成。创新的单管物理分隔设计避免了开盖操作，极大降低了污染风险，适合现场应用。
4.经济高效：反应总体积仅14 μL，仅使用试剂盒推荐标准体积的五分之一，成本低廉。
5.双模式输出：兼容实验室高灵敏荧光定量和现场可视化试纸条判读，应用灵活。
本研究成功构建了一种基于硒增强RPA与CRISPR/Cas12a集成的OTSRC检测平台。该平台实现了对HPV 16 DNA的超灵敏（169 aM）、快速（20分钟）、高特异性、低背景噪声的检测，其性能与qPCR相当，为宫颈癌的早期筛查，特别是在资源有限地区，提供了一种极具前景的POCT工具。
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货号
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA扩增试剂盒
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96T
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 试剂盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA基础型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA荧光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA试纸条型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA基础型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA荧光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA试纸条型）
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48T
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JY0209
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双靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0201
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单靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0307
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CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条
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50T
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JY0308
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CRISPR双酶切检测试纸条（变色龙）
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50T
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