RPA试剂盒——DNA恒温扩增试剂盒基础性引物筛选方案

基础型项目引物筛选逻辑概述

• 收到合成引物后再无任何阳性测试前提下，进行全阴性测试，确定阴性条带。

• 首先以质粒高、中浓度为模板，例如可选用1pg/μL和10fg/μL进行引物初筛，筛选目的条带特异明显、条带颜色亮、杂带少且阴性正常（无非特异性条带，引物二聚体少）的2-3对引物组合。

• 灵敏度实验要求模板做3-4个浓度，各个浓度的扩增条带呈现灵敏度变化，扩增条带亮度有变化，最终呈现的结果图要求最低浓度的检测结果为阴性。最优、次优引物组合，一般质粒灵敏度至少在1fg/μL。

• 将筛到的最优、次优引物探针进行实际样本实验，比较检验样本的灵敏度，选出目前最优的引物探针，一般假病毒的灵敏度是10³-10⁴copies/mL，根据不同项目灵敏度可能存在差异。

• 注意：凝胶电泳的结果图最好标注maker大小，目的条带大小

基础型项目引物筛选逻辑实际案例

1、每个项目建议设计合成3-6条上下游引物用于后续筛选。若筛选引物未符合灵敏度要求，可尝试在靶标的其他区域进行设计合成引物，再次筛选最终得到最优引物组合。

2、本实验案例在靶标上设计合成3条上游引物，3条下游引物，共9个引物组合进行示范。

Ø引物筛选1—全阴性验证

• 9组引物组合进行全阴性测试，确定阴性正常。

• 在扩增子大小长度范围无明显条带。

Ø引物筛选2（正筛）

• 随机固定一条上游引物（此实验选择F1），与3条下游引物组合；

• 模板选择高、中、低浓度测试，选择条带明显、低浓度有扩增的引物组合；

• 引物组合F1+R1与F1+ R3相对较优，R1/R3两条下游引物表现较好；

Ø引物筛选4(灵敏度确认)

• 确定最优引物组合F2+ R1后，进行初步灵敏度确认；

• 模板浓度的选择：筛选引物时能检出的最低浓度向上/向下选择1-2个梯度；

• 最终确认环节建议加上阴性对照，确认阴性始终正常。

Ø结果讨论

• 最优引物组合F2/R1，

• 初步判定质粒灵敏度0.1fg/uL。

下一步：

1、客户可根据自身项目需求进行引物加入量优化、反应时间优化等来提供灵敏度；

2、特异性交叉验证实验；

3、收集实际样本测试；

4、与市面上的PCR试剂进行灵敏度对比。

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