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Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosisYuanyuan Liu,Weicong Ren,Zhongtan Xue,Yuedong Miao,Wei Wang,Xuxia Zhang,Cong Yao,Yuanyuan Shang,Shanshan Li,Fengling Mi, Yu PangReceived: 24 February 2023 / Accepted: 23 May 2023

01  背景

结核病是世界上最紧迫的公共卫生问题之一。根据2022年世界卫生组织（WHO）全球结核病报告显示，2021年全球约1060万例新发结核病患者，死亡160万例，而结核病的确诊率却只有63%。目前结核病确诊手段耗时长，诊断延误会增加传播的机会。因此，开发一种快速、简单、灵敏的结核分枝杆菌检测方法尤为重要。

首都医科大学附属北京胸科医院副书记庞宇老师课题组在《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 》期刊上发表文章《Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosis》，影响因子4.5。

课题组开发了一种新的基于MIRA的分子检测方法，从临床标本中鉴定结核杆菌。依据文中实验结果显示，在结核病患者的临床诊断中，MIRA技术检测相对于qPCR的敏感性甚至有一定优势。

02   研究方法

课题组使用含有H37RvfullengthIS1081基因的重组质pEASY-Blunt-IS1081进行连续稀释分析，检测限为163个拷贝/反应。与传统qPCR相比，MTB的检测灵敏度提高了约1.5倍。

且在11个非结核分枝杆菌和其他临床细菌的特异性实验中，MIRA技术的特异性表现优秀

03   实验结果

灵敏度

采用含有IS1081基因全长的连续稀释重组质粒，测定实时MIRA检测MTB的灵敏度，并与qPCR进行比较。如上图a和c所示，两种检测方法的检测限均为每反应100拷贝。并做了Probit回归分析，MIRA技术检测在95%概率下的扩增限为163拷贝，而qPCR的扩增限为244拷贝。

特异性

分别对结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、异种分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、海洋分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、猪分枝杆菌等阳性样本进行检测。结果只有结核分枝杆菌呈现阳性，见上图曲线16。

 临床样本测试

为了验证实时MIRA的方法的临床性能，课题组检测了173份临床痰标本,临床样本分为5组：高、中、低、极低和阴性。以Xpert为金标准，MIRA的检出率为72.5%，明显高于qPCR的53.8%。

 实验结论

 除了具有良好的诊断准确性外，MIRA技术对结核病患者的临床诊断具有多种优势：

⭕ MIRA技术和qPCR 有着同等的灵敏度和特异性。

⭕检测可以在15-30 min内完成，优于qPCR（120 min）和LAMP（40 min），从而在结核病中提供了一种潜在的替代POCT。

⭕ 采用42°C的恒温温度扩增标本模板DNA。除了实时监测荧光信号外，在480 nm灯下，肉眼也可以检测到扩增子。

⭕MIRA技术不需要复杂的实验室环境和熟练的实验人员，这更适合在资源有限的环境中扩大规模。

⭕相比于qPCR，MIRA试剂检测的成本较低，可成为结核病流行国家常规使用的方法。