每年季节性甲型流感（IAV）反复暴发，全球每年十亿级感染病例、数十万死亡病例，我国也承担沉重医疗与经济负担。传统检测手段各有短板：抗原快检灵敏度不足、金标准RT-qPCR依赖昂贵热循环仪、等温扩增LAMP引物设计复杂易假阳性。

近期苏州团队发表于Current Microbiology的研究，搭建一套简化RT-RPA-CRISPR/Cas13a可视化检测体系，等温反应、试纸肉眼判读，78份临床样本与qPCR结果高度吻合，为资源匮乏地区快速甲流筛查提供落地化新工具，一起来看看这项实用型分子诊断技术！

甲型流感因抗原漂移、跨物种人畜共患、气溶胶高效传播三大特性，极易造成校园、养老院聚集性疫情，WHO明确指出早期快速诊断是阻断传播、及时使用奥司他韦的核心关键。

目前主流检测手段局限突出：

1. 病毒分离培养：可靠性高，但需BSL-2实验室，耗时3–7天，完全无法满足急诊快速筛查；

2. 抗原快速检测：操作简便，但灵敏度仅50%–70%，漏检风险高，无法区分流感亚型；

3. RT-qPCR（临床金标准）：特异、灵敏，但设备昂贵、单份检测成本高，整套流程2–4小时，基层、现场难以普及；

4. 传统等温扩增LAMP/RPA：LAMP需要4–6条引物，易非特异性扩增；单纯RPA荧光检测仍需配套光学设备。

同时临床诊疗仅需阴/阳定性结果，无需精准病毒载量定量，这也为简化型CRISPR检测平台提供了应用场景。

1. 技术原理两步走，全程等温、无需温控设备

整套检测分为等温扩增+CRISPR特异性识别两大模块，总耗时约40分钟：

1. 样本前处理：专用快速核酸释放试剂裂解咽拭子，仅需5分钟，同步添加RNase抑制剂避免RNA降解；

2. RT-RPA等温扩增（42℃，30min）

靶向甲流M基因高度保守区（H1N1/H3N2/H5N1同源性＞98%），引物5’端引入T7启动子；低温等温完成RNA反转录+DNA指数扩增，产物可作为T7转录模板；

3. Cas13a靶向剪切（37℃，20min）

扩增产物经T7酶体外转录为靶RNA，crRNA引导Cas13a识别目标序列，激活附带切割活性，无差别降解体系内报告探针；

4. 两种结果读取方式

荧光检测：FAM标记探针断裂释放荧光信号，仪器定量判读；

侧向层析试纸条（核心优势）：FAM+生物素双标记探针，阳性样本探针被切碎，金标抗体聚集在检测线（T线显色）；阴性仅质控线（C线）显色，裸眼5分钟即可判读，完全摆脱专业仪器。

 

其中使用了沃博生物warbio热门产品CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301.

2. 体系关键优化细节

1. 分析灵敏度（最低阳性检出浓度）

甲流核酸标准品10倍梯度稀释测试，体系最低可稳定检出10¹ copies/mL病毒基因组，试纸条与荧光检测结果一致，远优于多款传统RPA-试纸联用方案。

2. 特异性无交叉反应

纳入甲流B型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感、新冠等十余种常见呼吸道病原核酸平行检测，仅H1N1/H3N2/H5N1甲流亚型出现阳性信号，无任何交叉干扰，诊断特异性拉满。

3. 临床样本验证（核心亮点）

收集78份流感季鼻咽拭子：63份qPCR甲流阳性、15份阴性样本，同步采用本平台检测：

✅ 灵敏度100%、特异性100%，与RT-qPCR金标准完全吻合；

✅ 阳性样本试纸全部清晰出现T线，阴性仅保留C线，无假阳、假阴性案例。

1. 轻量化低成本：无需微流控、纳米增强等复杂工艺，仅基础恒温金属浴即可完成反应，试纸肉眼判读，适配乡镇医院、社区、野外应急检测；

2. 操作流程简化：配套快速核酸释放液，省去传统核酸提取纯化繁琐步骤，减少核酸损耗；

3. 耗时大幅缩短：全程40分钟（5min裂解+30min RPA+20min CRISPR），优于SHINE等主流CRISPR多通路检测；

4. 通用性强：靶向M基因保守序列，理论可覆盖全部甲流亚型，后续可搭配亚型特异性crRNA拓展分型能力。

1. 检出限仅初步验证，梯度稀释跨度大、重复次数少，需细化梯度、增加样本量完成标准化LOD验证；

2. 两步开盖操作存在气溶胶污染风险，易产生假阳性，后续开发单管闭管一步法体系；

3. 临床样本量仅78例，缺乏多中心、大样本队列验证，未开展病毒亚型分型；

4. 试纸条判读存在人为视觉主观误差，未来搭配自动化读条仪统一判定阈值；

5. 无定量能力，仅适用于定性初筛，重症需病毒载量监测仍需依赖RT-qPCR。

本研究立足临床实际需求，跳出复杂高端设备依赖，把CRISPR-Cas13a分子诊断技术做“简”、做“实”，通过等温扩增+层析试纸组合实现甲流快速可视化检测，临床吻合度达100%。

虽现阶段仍有优化空间，但为POCT（即时检测）甲流诊断提供了低成本、易落地的全新技术路线，对呼吸道传染病快速防控具有重要实践参考价值，也为其他病原快速检测体系开发提供标准化思路。