01  传统检测方法

目前水稻干尖线虫主流检测手段各有局限：

1. 形态学鉴定：干尖线虫同属近缘物种形态高度相似，鉴定难度大，难以大面积推广；

2. 常规PCR、环介导等温扩增（LAMP）：灵敏度有限，检测下限约为10³拷贝/μL；

3. 实时荧光定量PCR（qPCR）：灵敏度虽高，但设备昂贵、检测耗时长，还需要专业操作人员，无法满足基层田间、口岸现场快速筛查的需求。

亟需一种操作简单、低成本、高灵敏、不依赖精密仪器的分子检测技术。

02  全新检测体系：RPA-Cas12a-Ab技术原理

本研究选取水稻干尖线虫18S rRNA基因的ITS区作为靶标序列，该区域物种特异性强，可有效区分近缘线虫。整套检测流程分为三步，全程仅需45分钟：

1. RPA等温扩增：37℃恒温条件下，完成靶标DNA预扩增，耗时20分钟；

2. Cas12a酶切反应：Cas12a在crRNA引导下识别靶标DNA，激活旁切活性切割报告探针，耗时20分钟；

3. 结果判读：可选择荧光检测仪或侧向流动试纸条（LFA） 两种方式，5分钟内读取结果。

研究团队从8条候选crRNA中筛选出活性最优的crRNA5，大幅提升Cas12a的识别与切割效率，保障检测稳定性。

其中，使用了沃博生物Warbio热卖产品CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301.

03技术核心优势

1. 特异性强，无交叉反应

研究选用草莓滑刃线虫、亚滑刃线虫、南方根结线虫等近缘及常见植物寄生线虫开展验证，该体系仅对水稻干尖线虫呈阳性，不会与其他线虫、水稻基因组DNA发生交叉反应，有效避免假阳性。

2. 灵敏度表现优异

- 荧光检测版本：检测下限低至1拷贝/μL质粒DNA，单条线虫DNA经10倍稀释后仍可稳定检出，灵敏度远超传统PCR与qPCR；

- 试纸条可视化版本：检测下限为10³拷贝/μL质粒、0.96 ng/μL线虫基因组DNA，灵敏度与常规PCR持平，完全满足检疫筛查要求。

3. 恒温反应，适配现场检测

整套反应全程维持37℃常温，无需PCR仪等精密温控设备。搭配侧向流动试纸条后，室温即可完成结果判读，操作门槛极低，基层农技站点、种子口岸、田间地头都可直接使用。

4. 检测效率大幅提升

传统PCR、qPCR检测通常需要1~3小时，而RPA-Cas12a-Ab从样本处理到出结果全程不超过45分钟，极大提升批量样本的筛查效率。

04  应用前景与总结

水稻干尖病依靠带菌稻种传播，是水稻种业检疫的重点对象。这套RPA-Cas12a-Ab检测体系融合了RPA等温扩增的便捷性与CRISPR/Cas12a的高特异性，同时搭配试纸条实现结果可视化，兼顾高灵敏、高特异、快速、便携四大特点。

该技术突破了传统分子检测对专业设备和实验环境的依赖，不仅适用于水稻种子检疫、田间病害监测，也为其他植物寄生线虫的快速检测提供了可借鉴的技术思路，在农作物病害防控、进出境植物检疫领域具备广阔的落地应用价值。