Single Cell Sequence Specific Amplification Kit
| 货号 | 22121 | 售价（元） | 2150 |
| 规格 | 200 rxn | CAS号 |
- 产品简介
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产品描述
Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的预扩增方法，适用于单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增，便于进行单细胞转录组表达差异的分析。本试剂盒实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR预扩增反应在同一管内完成，不需要额外的操作，简单高效，还能减少实验误差和污染风险。除了应用于单细胞，本试剂盒亦可适用于2~1,000个细胞的一步扩增，应用时仅需按照细胞数目减少一步扩增的循环数；获得的扩增产物适合于任何实时荧光定量PCR分析法。染料法和探针法qPCR分别推荐ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。
产品优势
✽ 一步法RT-PCR预扩增：细胞裂解、RNA逆转录和PCR扩增在同一管内完成，不需要额外的移管操作。
✽ 一次可扩增500个靶基因：扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析。
实验案例
分别使用ToloBio #22121与竞品Supplier A、Supplier B，对不同浓度的小鼠巨噬细胞进行一步法RT-PCR预扩增，产物进一步qRCR（ToloBio #22204）扩增，比较在相同引物和相同细胞个数条件下的扩增情况，包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示，ToloBio #22121在不同浓度细胞（1～1000个细胞/test）条件下扩增性能稳定、优异。
实验流程
1.Primer Pool的制备
将不同待测基因的扩增引物进行混合，制备成Primer Pool，使各引物的终浓度为0.1 μM。以Bcl-2基因为例，其上、下游引物原浓度均为100 μM，则应各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至终体积为1 mL。多个基因引物对的制备依此类推，最多可混合500对不同基因的扩增引物。
2.预扩增反应体系
在RNase-free离心管中冰上配制如下反应体系：
|
组分 |
体积 |
|
2 ×Tolo scAmp Reaction Buffer |
2.5 μL |
|
Primer Pool (0.1 μM) |
0.5 μL |
|
RT/Taq Enzyme Mix |
0.2 μL |
|
Cell sample a |
0.5~1 μL |
|
RNase-free ddH2O |
Up to 5 μL |
a.细胞可储存于PBS缓冲液中。
以上体系（除细胞样本外）充分混匀后冰上放置备用，可加入1~1000个细胞样本。为了使细胞充分破碎，将加入细胞样本的完整体系置于-80℃冰箱2 min，随后3,000 rpm (1,000 × g)室温或4℃离心2 min，然后立即放入PCR仪进行如下反应：
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程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
反转录 |
50℃ |
60 min |
1 cycle |
|
预变性 |
95℃ |
3 min |
1 cycle |
|
循环反应 b
|
95℃ |
15 sec |
20 cycles
|
|
60℃ |
15 min |
||
|
Hold |
4℃ |
- |
- |
b.建议循环数随起始细胞数量作相应调整：1个细胞20个循环，10个细胞17个循环，100个细胞14个循环，1,000个细胞11个循环。
反应结束后，每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀释)，用移液器吹打混匀，室温短离集于管底。可立即进行后续qPCR定量反应或-20℃短期保存。
3.qPCR反应体系
冰上配制如下反应体系：
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组分 |
体积 |
|
2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal,#22204) |
10 μL |
|
Primer F (10 μM) |
0.5 μL |
| Primer R (10 μM) |
0.5 μL |
|
Template DNA c |
1 μL |
|
ddH2O |
Up to 20 μL |
c.为减少加样误差，建议将1:5稀释的预扩增产物再稀释10倍后使用。
以上体系充分混匀后，短暂离心集于管底，随后立即放入qPCR仪进行如下反应：
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
Stage 1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
|
Stage 2
|
循环反应
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95℃ |
10 sec |
40 cycles
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|
60℃ |
30 sec |
|||
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Stage 3 |
熔解曲线 |
仪器默认程序 |
|
1 cycle |
产品组成
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组分 |
22121 (200 rxns) |
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● 2 × Tolo scAmp Reaction Buffer d |
500 μL |
|
● RT/Taq Enzyme Mix e |
40 μL |
|
○ RNase-free ddH2O |
2 × 1 mL |
d.包含 dNTP；
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase；
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；