产品信息

      牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将 7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与 mRNA 的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为 RNA 加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0 结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的 RNA 的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1 和D12）组成 （图 1a），D1 亚基执行 RNA 三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12 亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的 Cap 0 结构 m7Gppp5´N 都是必须的（图 1b）。 

a.  b.  

图1. 牛痘病毒加帽的结构和作用机理。a. 牛痘病毒加帽酶和 GTP（红色）、SAH（玫红）的共结晶结构 (PDB 4CKB) 。该酶由 D1 和 D12 两个亚基组成，兼具RNA 三磷酸酶（蓝色）、鸟苷转移酶（橙色）和鸟嘌呤甲基转移酶（米黄色）的功能。本图引自 Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. b. mRNA 的帽结构是由一个 7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0 结构由相邻的 RNA 链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成 cap-1 结构需要2’-O-甲基转移酶的参与，该修饰可以降低 RNA 在体内引起的细胞先天免疫反应。本图引自 Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。 
     本体系可用于 IVT RNA 的加帽反应，使加帽反应在 1h 之内完成，效率接近 100%，并且保证正确的方向。IVT 推荐使用近岸蛋白质 T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。 
产品用途：
      体内或体外翻译前 mRNA的加帽和 mRNA的 5’末端标记。     
注意事项：   
     SAM：需事先计算好 SAM 的用量，在反应开始前把分装的 32 mM 的储备液稀释成 2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免 SAM 降解，该工作液需要保存于冰上。 
     RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的 RNA 进行纯化并溶解于 RNase-free 水中，不能将 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他盐溶液中。 
     RNA 二级结构：一些 RNA 转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的 5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热 RNA 可以去除转录产物 5´端的二级结构，如果转录产物的 5´端结构复杂，可以把加热时间延长至 10min，加帽反应时间可延长至 60min。 
     Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之间的差异在 RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1 结构提高了 mRNA 的翻译效率。 


      近岸蛋白质 Vaccinia Capping System 可以与 mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase（货号：M072）在一个体系内同时工作产生Cap 1 结构。当使用新的细胞系或翻译系统时，建议比较 Cap 0-和 Cap 1-mRNA 翻译效率和免疫原性，以确定最佳的帽子结构。 
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白质 E. coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在进行 RNA 转染实验前做纯化处理。 
      RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入 0.5 µl 近岸蛋白质 RNase 抑制剂（货号：E125），同时去掉等体积的 RNase-free 水。 
      RNA5’端标记：在用于 RNA 5´端标记时，GTP 储备液应稀释到 mRNA 浓度的 1-3 倍。 
For research and manufacturing use only.