目标‌：开发一种‌无需复杂设备、快速、高灵敏度、高特异性‌的检测方法，适用于现场和临床诊断，以改善绵羊布鲁氏菌病的防控。

CRISPR/Cas12b-MCDA平台‌‌原理‌：‌MCDA扩增‌：在恒温（65°C）下，使用10条特异性引物对绵羊布鲁氏菌的特异性基因（BOV_A0500）进行快速、高效的等温扩增（45分钟）。

‌CRISPR/Cas12b检测‌：扩增产物中含有PAM序列，可被Cas12b/gRNA复合物识别并激活Cas12b的“反式切割”活性，切割单链DNA（ssDNA）报告探针。

其中，使用了沃博生物(Warbio)相关产品,CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条,货号JY0301，兼容性表现良好。

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结果判读‌：

可通过三种方式可视化结果

‌实时荧光分析‌：切割荧光探针释放荧光信号。‌

紫外可视化‌：在紫外灯下观察反应液颜色变化（阳性呈亮绿色）。

‌侧流层析生物传感器（LFB）‌：使用试纸条读取结果，阳性显示两条红线（检测线和控制线）。

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平台优势与流程‌‌

快速‌：从DNA提取到完成检测，实时荧光法约需‌75分钟‌，LFB法约需‌90分钟‌。‌

设备简单‌：LFB和紫外可视化法无需复杂仪器，仅需恒温设备（如水浴锅）。

‌防污染设计‌：在MCDA预扩增系统中加入了‌尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和dUTP‌，可有效消除高达10⁻¹² g/μL浓度的残留污染，显著降低假阳性风险。

灵敏度‌:对纯化基因组DNA的检测限低至‌10 fg/μL‌，比实时浊度分析和MG比色法的灵敏度高10倍。对模拟绵羊全血样本的检测限为‌100 CFU/mL‌。

特异性‌：对28株菌株（包括9株布鲁氏菌和19株非布鲁氏菌）进行测试，结果显示‌100%特异性‌，仅绵羊布鲁氏菌呈阳性，与其他布鲁氏菌种及非布鲁氏菌病原体‌无交叉反应‌。

临床样本验证‌：对60份模拟绵羊全血样本进行检测，与普通PCR相比，CRISPR/Cas12b-MCDA法显示出‌100%的一致性、灵敏度和特异性‌，且灵敏度高于PCR。