ClearSee™ 是一款植物透明化试剂，仅需固定、洗净、透明化3步操作即可轻松实现植物组织的透明化。本方法由名古屋大学研究生院的栗原大辅博士等人开发。

作为植物科学的研究工具，ClearSee™ 有望用于阐明细胞水平的现象与生物个体之间的系统联系。

<资料提供>

名古屋大学研究生院 理学研究科

特聘助教栗原大辅、先驱研究员水多阳子

 

◆特点

● 植物用透明化试剂

● 无需制备切片，即可荧光观察植物内部的整体结构

● 操作仅需3步：①固定、②清洗、③透明化

 

◆可透明化的组织

植物

 

◆透明化所需时间

根茎：1~2日、叶和幼苗：4~7日、雌蕊：2周、成熟组织：4周

※ 上述时间仅供参考。透明化所需的时间因植物种类以及组织不同有所差异。

 

◆透明化所需的试剂

▼试剂

1.   ClearSee™

2.   纯净水

3.   多聚甲醛 (产品编号：160-16061)

4.   2 mol/L 氢氧化钠溶液（产品编号：194-05361)

5.   10 x PBS (产品编号：163-25265)

6.   1 x PBS (产品编号：164-25511)

7.   亚硫酸钠（产品编号：198-03412） ※仅在使用ClearSeeAlpha时需要使用

 

 

▼仪器

1. 高压灭菌锅 2.  局部排气设备（如通风室） 3.  真空泵 4. 干燥器 5. 60℃恒温器 6.  锥形管 7.  微管	8.  封口膜 9.  针 10.  镊子 11.  盖玻片 12.  载玻片 13.  凡士林 14.  ClearSee™透明化标本用荧光显微镜※和推荐物镜※※
※共焦显微镜、双光子显微镜 ※※请准备适配折射率 (RI=1.41)的物镜，建议在获取数据之前咨询显微镜制造商。

 

 

ClearSeeAlpha是什么？

ClearAlpha是改良版的ClearSee™，改良方法为向ClearSee™中加入亚硫酸钠至50mM。使用常规款ClearSee™进行透明化时，部分种类植物的叶和果实会因氧化而变成褐色，导致难以观察，而亚硫酸钠的还原作用可以实现清晰的观察。

请根据需求制备ClearSeeAlpha，即配即用。

 

◆Protocol

Protocol（视频）

请查看以下文献：

Kurihara, D. et al., : J. Vis. Exp., e63428, 179(2022).
doi:10.3791/63428

 

 

◆应用示例

拟南芥（叶/根）的观察示例

图1. 透明化的拟南芥叶

明亮视野中组织呈透明状，叶绿素的红色自发荧光消失。由于可以观察完整的叶片，因此也可以观察到内部维管束中的荧光蛋白。

图2. 使用ClearSee™处理4日的拟南芥根1）

生长素应答细胞的细胞核用绿色显示，全身细胞的细胞核用紫色显示。

*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改编并转载。

 

雌蕊的荧光观察示例

图3. 观察完整透明化后的雌蕊2）

花粉管上使用4种荧光蛋白（蓝色、绿色、黄色和红色）分别进行标记。

*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改编并转载。

 

 

其他植物

图4. 透明化的植物叶片

使用ClearSee™处理6天的蓝猪耳、矮牵牛、烟草、番茄、黄瓜、水稻※的叶片。

※  对水稻进行透明化处理时，由于水稻叶片表面存在蜡质层，溶液难以渗透到组织中。因此在固定操作之前，请将叶片浸泡在氯仿等有机溶剂中10~30 s，以去除蜡质。

 

 

子房和角果的观察示例

图5. 左：ClearSee™、中：ClearSee改良方法（＋50mM 2-氨基乙硫醇盐酸盐）、右：ClearSeeAlpha（＋50mM 亚硫酸钠

通过向ClearSee™中加入50 mM亚硫酸钠（即“ClearSeeAlpha”法），可抑制氧化导致的褐色色素沉着。

*由Kurihara, D. et al., : Plant Cell Physiol., 62(8), 1302-1310 (2021)改变并转载

 

拟南芥（种子）的观察示例

对授粉5天后的拟南芥种子进行透明化处理，并用香草醛染色单宁。

使用ClearSeeAlpha法的种子在15天后可确认到氧化单宁的去除效果，可对透明化的种子进行观察。