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基于CRISPR/Cas的分子检测

也许一提到CRISPR/Cas技术,人们的第一反应是,CRISPR/Cas技术是一个高效的基因编辑系统。其实,CRISPR/Cas系统是一个多面手,不仅具有高效基因操作功能,还具有分子检测能力。CRISPR/Cas是(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associate)成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白质缩写,它是微生物的天然“免疫系统”。

本文带您了解一下CRISPR/Cas高效的分子检测能力,CRISPR/Cas系统不但可以检测核酸分子(DNA/RNA),还可以检测非核酸分子(小分子化合物、重金属、蛋白质、肿瘤循环细胞、外泌体等)。参与分子检测常见的CRISPR/Cas系统有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。
01  核酸分子检测

CRISPR/Cas系统在引导RNA(guide RNA,gRNA)的引导下识别目标核酸(DNA/RNA)序列后,激活Cas蛋白对靶向和非靶向核酸(DNA/RNA)分子切割。CRISPR/Cas系统在靶向识别和切割过程中转化靶标核酸分子信号为检测仪器或肉眼可观察的信号。

依据检测核酸分子类型,CRISPR/Cas技术核酸检测可分为DNA(CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas12识别DNA序列)和RNA(CRISPR/Cas13识别RNA序列)检测。不同的CRISPR/Cas系统识别的核酸类型不同,然而检测过程中为了实现同一个CRISPR/Cas系统对DNA和RNA均能够检测,必须借助于转录技术(transcription,T)和逆转录(reverse transcription,RT)实现DNA与RNA的相互转化。

根据检测核酸分子时是否需要体外核酸扩增,CRISPR/Cas技术核酸检测可分为辅助体外核酸扩增检测和无体外核酸扩增检测两类。辅助体外核酸扩增检测需先利用PCR、重组酶聚合酶等温扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)等技术,对靶向核酸序列进行体外扩增,随后再通过CRISPR/Cas系统检测靶标分子。与之不同,基于CRISPR/Cas的无体外核酸扩增检测技术,能够直接对靶标核酸进行检测,具有操作步骤简便、检测耗时短、污染风险低等优点。

CRISPR/Cas核酸检测系统能够将靶向DNA分子信号高效转化为荧光、化学、电化学等肉眼可见或可检测的信号,以此实现对靶标核酸信号分子的精准检测。在实际应用领域,该技术已广泛用于多种病原体和基因特征检测,包括寨卡、乙脑病毒、非洲猪瘟病毒、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸检测,以及DNA甲基化分析、HPV16和18基因分型等。值得一提的是,基于CRISPR/Cas13开发的SARS-CoV-2核酸检测系统,无需进行体外核酸扩增,检测下限约为31拷贝/μl,仅需20分钟即可完成检测。此外,同样基于CRISPR/Cas13构建的多通道荧光信号核酸分子检测系统,一次能检测169种人类相关病毒核酸,具备高通量、检测迅速、成本低廉等显著优势 。

02  非核酸分子检测

随着对CRISPR/Cas分子检测技术研究的逐步深入,检测的靶标分子类型也逐渐丰富,可实现循环肿瘤细胞、小分子化合物、蛋白质分子、金属离子、酶活性、抗生素、病原微生物等靶标检测。检测样本类型从单一逐步走向复杂多样,涵盖人的血液、体液、牛奶、食品、环境样本等。目前应用于非核酸分子检测的CRISPR/Cas系统主要有Cas12a和Cas13a。CRISPR/Cas12a可以有效地检测外泌体,此过程通过适配体技术与CRISPR/Cas12a技术联合,转化外泌体信号为仪器可检测信号。伴随着检测系统的优化,检测时间从120 ~20 min逐渐缩短,可实现POCT。CRISPR/Cas检测的靶标分子从病原微生物到小分化合物,凸显了CRISPR/Cas可检测非核酸靶标分子的广泛性、样本类型的普遍性以及检测操作的便捷性,非常适合海关、车站、学校等场所的POCT。

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TwistAmp Basic Kit DNA扩增试剂盒

96T

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96T

B8201C1

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48T

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Cas酶系列:

 

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32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

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LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

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100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

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Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

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AsCas12a (Cpf1)

32104-03

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AsCas12a (Cpf1)

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1,000 pmoL

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