1.Q：PKMITO可以染植物细胞线粒体吗

A：目前测试了几种植物样本，衣藻、花粉管都有成功的案例，根尖细胞和拟南芥叶片效果都不理想，所以一般不推荐使用PKMITO染料标记植物细胞线粒体。除了带细胞壁的样本存在透膜问题，植物细胞线粒体内外膜电势差也比动物细胞小，所以也可能存在标记问题。原生质体可以染，但效果一般。

2.Q：维拉帕米的用法

A：对于一些不容易透膜标记靶点的染料，在不影响实验设计的前提下，我们推荐使用维拉帕米（一种钙通道阻滞剂）增加染料在细胞内的保留，以提高染色效率，染料是否推荐搭配使用请参考染料的网站介绍或网站产品详情页的电子版说明书。

具体用法一般建议是1-10μM的终浓度，在整个染色到拍摄的全过程中都使用，例如在配置染色工作液时即加入适当浓度的维拉帕米，然后进行孵育染色，在染色结束如果进行进一步清洗，那么在清洗后仍然加入适当浓度的维拉帕米，以保证长时间拍摄时的稳定性。推荐货号：麦克林 V875827;中国上海

3.Q：线粒体探针染了细胞，荧光能保留多久

A：在以往的实验中，用PKMITO染料染完色后，细胞传一代基本都还能保留荧光，所以几天之内基本上都有荧光。

4.Q：actin染料和fastact有什么区别

A：这两款染料分子上带的定位基团不一样，fastact系列是迭代的更优化的版本，生物相容性更好，细胞毒性更低。但化学结构的优化不代表在每种生物样本中都能带来优化的效果，成像最终效果或许没有质的差别。

5.Q：spirochrome的染料能不能用在植物或者海洋生物中

A：膜张力探针可以用在植物细胞上，其他染料不能。Tag类的染料可以标记，但需要转染表达的操作。“All our probes do not work in live plants and whole marine organisms (e.g. sea urchin embryos, jellyfish, sea star, etc) with the exception of Flipper-TR, which has been shown to work in plants.It seems the probe do not penetrate into the cells due to additional barriers (e.g. cell wall)”

6.Q：PKZinc系列几种染料的区别

A：PKZnR-5的亲和力最强 信噪比也最高 所以检测信号的效果最好；换句话说1能做的实验5理论上都能做的更好，R1-R5本质区别就是亲和力，R1 FR1/2/3的亲和力都一样 都比R5低不少。

7.Q：几款线粒体染料有什么区别

A：PKMITO系列四款产品：前三个是活细胞染料，是最好用热度最高的，它们有两个区别：一是激发通道不同，成像质量都一样，是超分辨水平的染料，抗淬灭、低光毒性；二是orange这款更适合做STED成像，另外两个通道不适合拍STED；第四款带FIX后缀的是可固定版本染料，也需要活细胞染色，染完后可以固定，但是这款染色没有活细胞染料易用，对技术要求更高一些，摸条件的难度更高。

PK Mito Orange Fix这款染料的使用难度大，不适合做超分辨比较少的用户，它的透膜效率在一些细胞种类上较低，染色条件不好摸，仅照着说明书的话不容易做出来，而且不管哪个角度，固定后的线粒体，成像效果是不如活细胞的，因为不管怎么固定，线粒体肯定都会有损伤，所以这款染料只是提供了固定线粒体拍摄的一种解决方案，但并不具有普适性，只适合进阶玩家或者特殊实验需求。当然我们还在开发使用更简单的fix染料，提高fix染料的使用范围，目前还在研发过程中。

HBmito这款产品作为线粒体染料的新品，主打远红通道的STED显微镜成像场景的应用，其作为活细胞染料的话，成像性能略逊于PKMITO系列，但PKMITO系列不支持远红通道的STED应用；而且HBmito是允许固定的，固定后的效果比mitotracker稍好一些，固定后是否能做超分辨，我们还在测试。

8.Q：线粒体染色后背景过高或者线粒体形态不好有哪些可能，怎么优化？

A：背景过高，导致线粒体信号太强看不出来形态，首先考虑染色浓度太高了，可以将染色浓度降低一些，考虑1：2000或者更低（根据实际成像结果或者信号强度判断），还有不要室温染色，线粒体本来就是对环境敏感的细胞器，除非样品本身孵育温度就是室温，否则要在37℃，其次在染完色后，可以用共聚焦设备/模式看看染色效果，看一是背景是否过高，二是线粒体形态是否良好，如果都不错，清洗1-2次后换上新的预热的培养基，再孵育20-30min，这样线粒体形态会更好，背景会更低。

超分辨成像是很综合很注重细节的实验，所谓三分染色七分拍，一定要注意样本的状态是否良好，样本状态对于成像结果的影响比想象中要大很多，也不必拘泥于说明书步骤，因为实验影响因素太多，说明书只能提供一些基础框架，这种操作上的宽容度既是超分辨实验的的优势也是难点，一定是要参考实际成像效果进行条件优化的，优化的目的是用最少的染料，完成染色标记需求，减少各种试剂对细胞的影响。

9.Q：有没有内质网染料

A：没有，目前推荐的超分辨标记内质网的方式为转染荧光蛋白（超分辨门槛，适用于SIM显微镜并向下兼容）；或者利用蛋白标签技术如Halo Tag蛋白标签或者SNAP蛋白标签，先利用标签质粒在内质网上表达相应的tag，再利用CA或者BG系列产品去标记tag，这是一种稳定的间接标记手段，依赖于我们优化的CA/BG系列探针，可达到稳定的超分辨成像效果（适用于STED、SIM显微镜并向下兼容）。

相关产品：