建立灵敏、快速的RPA检测，依赖于合适扩增引物的选择。由于目前还不能完全根据引物的序列特征来预测其扩增性能，建议通过实验的方式来筛选一些列候选引物来确定最优引物对。

Note：对于检测要求不高的实验（模板超过1000个拷贝），大多数情况下只需要进行少量筛选，即可找到合适引物对，甚至使用PCR引物就足以用于反应。对于高灵敏度分析，建议按照以下设计方案进行筛选。

1.     靶序列的选择

如果是用于检测临床样本，那么合适的靶序列，一定是尽可能保守的。虽然RPA技术对引物和模板之间的匹配要求不是那么严谨，但是过多不匹配的碱基，必然会影响扩增的效率，从而使得准确率和灵敏度下降。

2.     引物长度

为PCR设计的引物通常可以用于RPA反应，但扩增效率可能不高。RPA引物的理想长度为30~35bp，比典型的PCR引物长。不同于PCR反应，RPA反应的过程不依赖于温度变化，因此引物的Tm值和RPA反应扩增效率之间没有很强的关联性。相反，许多RPA引物也可用于PCR扩增，但它们在PCR中的扩增性能可能与其作为RPA引物的扩增性能没有直接关系。

短于30bp的引物仍然可以用于RPA反应。然而，与>30bp的引物相比，其扩增效率通常更低。对于大于35bp的引物，其依然有可能获得很好的扩增性能。但是引物越长，其形成引物二聚体的可能性越大，反而影响特异产物的扩增效率。因此，不建议设计过长的引物。

3.     引物序列

引物的序列直接的影响着RPA反应的扩增效率，目前还不能完全根据引物的序列来预测其扩增性能。虽然有一些根据经验观察而建立的指南，但这并不能替代实验的方式来检验引物的实际效率。

在大多数的情况下，最好避免引物中特殊的序列结构，例如某个特定连续的核苷酸或大量的短重复。GC含量过高(>70%)或过低(<30%)可能不利于反应。另外，尽量避免可在引物内部或者引物引物之间形成引物二聚体或者发夹结构的序列。

         4.     扩增产物长度

Note：引物噪音即扩增反应中由引物产生的非特异扩增。由于引物噪音的影响，RPA中的扩增产物的大小直接影响着扩增反应的灵敏度和速度。虽然引物的噪音与RPA产物的长度无关，但更长的RPA产物需要更长的倍增时间。因此，扩增产物越长，引物噪音的扩增越有可能超过目的片段的扩增。所以，较短的扩增产物对超敏度分析有利。

如果在检测中使用探针，那么在设计RPA扩增引物时必须注意为探针的设计留出足够的序列空间。

5.     引物选择

引物选择过程通常包括以下步骤:

1)    目标序列的选择：

建议在模板中选择一个区域，其特征在于相对“平均”的核苷酸序列组成:

l  GC含量在40%和60%之间

l  重复序列

l  少数正向/反向重复，回文

       尽量避免选择扩增模板中的重复序列以保证目标序列的唯一性。在这方面，目标序列的选择与PCR中的选择原则一致。

2)    候选引物

选择合适的目标区域后，选择两组相互面对(即具有正向和反向)的交错引物作为候选引物。相同方向的引物可以重叠，但不是必须重叠。来自正向组的每条引物可以随后与来自反向组的每条引物配对。筛选一对可用于检测单分子DNA模板并且倍增时间短于20秒（RPA指数扩增期，产物增加一倍所需的时间）的引物，通常需要每个方向有8-10条候选引物（也就是说，64-100对引物组合）。

如果对引物的扩增效率要求不高(例如：样品中被检测的样本浓度相对较高)，可以在PCR引物设计软件中直接设定以下参数:

l  引物大小最小30bp，最大36bp

l  引物GC%最低20，最高70

l  引物Tm最低50，最高100

l  单核苷酸重复的最大允许长度，例如“CCCCC”设置为5。

3)    引物的筛选

见引物的三级筛选。

6.     困难的扩增

在某些情况下，扩增序列内部的基序(即引物之间的序列)对快速扩增不利，并且只要扩增产物中包含了这段序列基序的引物都表现不佳。尝试为特定的目的区域设计合适的引物，却始终无法达到预期目标的扩增。那么，如果可以的话，尽量选择其它不含这段基序的区域作为目标扩增区域。

7.     引物噪音

       通常除了特异性扩增发生之外，RPA反应体系也容易引起引物之间非特异性扩增的发生。这种非特异性扩增可以是由分子内的(发夹结构)序列引起，也可以是由相同或不同引物之间的序列所引起。这种非特异性扩增可以产生可检测水平的信号，即引物的噪音。噪音反应与特异性扩增过程竞争(对于引物、核苷酸、聚合酶结合和能量),并将最终抑制后者。产生噪音的倾向会影响特定引物对的灵敏度。由于这个原因，引物的选择尤为重要。

8.     简并引物和错配

RPA通常对错配是耐受的。有研究表明，当引物和探针携带5-9个碱基对错配时，RPA的扩增性能可能不受影响。因此，可以尽量减少在RPA反应中使用简并碱基。

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