PE和PE串联染料在流式抗体中为什么常见？_南京沃博生物科技有限公司

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PE和PE串联染料在流式抗体中为什么常见？

浏览：616 发布日期：2024-07-12 16:05:25

PE(藻红蛋白，Phycoerythrin)是从红藻中分离出来的240 kDa 藻胆蛋白。它发出强烈的黄橙色荧光（比荧光素亮约 25 倍），摩尔消光系数为 1,960,000 cm -1 M -1，荧光量子产率为 0.84。天然状态下的 PE 荧光光谱具有三个吸光度峰，一个主吸光度峰位于 565 nm，两个次级吸光度峰位于 496 nm 和 545 nm，一个发射峰位于 574 nm。这三个吸光度峰提高了与配备蓝色 (488 nm)、绿色 (532 nm) 和黄色激光 (561-568 nm) 的成像仪器的兼容性。

在使用PE之前，必须先将其与具有生物特异性的分子（例如抗体、链霉亲和素或膜联蛋白V）结合。PE和PE串联结合物通常用于流式细胞术、微阵列和 ELISA，由于其快速光漂白特性，在免疫荧光显微镜中的用途有限。

图1.PE的荧光光谱

R-PE（R-藻红蛋白，R-Phycoerythrin）是一种特殊类型的藻红蛋白，其主要吸收峰在 565 nm，次要吸收峰在496和545 nm。不同物种的 R-PE 中次要吸收峰的相对突出程度存在很大差异。PE 有三种亚基：α（20KDa）、β（20KDa）和γ（30KDa）。R-PE的α亚基仅包含藻红蛋白 (PEB) 发色团，而β和γ亚基则同时包含PEB和藻尿蛋白 (PUB)。不同物种的 PE 吸收光谱的变化反映了亚基的 PEB/PUB 比率的差异。R-PE和密切相关的B-PE 是荧光最强烈的藻胆蛋白，量子效率可能超过90%，并且其橙色荧光在任何中等浓度的溶液中都可以用肉眼轻易看到。

图2.RPE的荧光光谱

#AAT PE&R-PE的优点

长波长发射曲线最大程度地减少了生物材料的自发荧光

藻胆素与蛋白质骨架共价结合，导致荧光猝灭最小

水溶性极高，有利于结合反应的化学操作

显著的Stokes位移和可解析的发射光谱，适用于流式多色分析

多个位点可与抗体、花青染料或iFluor ^®染料等有机和合成化合物稳定结合

用于多色流式细胞术的串联染料——使用单一激发光产生一系列发射信号。

图3.顶部）使用4激光光谱流式细胞仪生成光谱图。使用空间偏移激光器（355 nm、405 nm、488 nm 和 640 nm）创建四个不同的发射曲线，然后组合起来产生整体光谱特征。

底部）用 PE 抗人 CD4 *SK3* 偶联物染色的 PBMC 的流式细胞术分析。使用 Aurora 光谱流式细胞仪在PE特异性 B6-A 通道中监测荧光信号。

PE串联染料是由两种不同的共价连接的荧光团组成，一个供体（例如R-PE）和一个发射较长波长荧光的受体（例如 Cy5 ^®、Cy7 ^®或 iFluor ^® 647）。在流式细胞术中，串联染料非常适合细胞的多色参数分析。图4说明了FITC、PE、PE-Cy5 ^®和PE-Cy7^® 的出色光谱分离，无需大量补偿即可实现细胞的四色分析。此外，所有四种荧光团都能被 488 nm 氩离子激光同时有效激发。

图4.FITC（绿色）、PE（黄色）、PE-Cy5 ^®（橙色）和 PE-Cy7^®（红色）的吸收和发射光谱表明，它们具有清晰的光谱分离，可以对细胞进行四色分析。所有四种荧光团均被 488 nm 氩激光线（蓝色）有效激发。FITC 可使用 FITC 滤光片组进行可视化。PE 可使用 Cy3 滤光片组进行可视化。PE-Cy5 ^®和 PE-Cy7^®可分别使用 Cy5 和 Cy7 滤光片组进行可视化。