卡那霉素（Kan）是一种含有顺二醇的氨基糖苷类抗生素，通常用于畜牧业和水产养殖业预防细菌感染。卡那霉素大多由动物的肾脏代谢为糖苷并通过尿液排出，但Kan的滥用导致动物源性食品和水样中存在抗生素残留，最终可能在人体内产生累积，可能会导致多种严重的副作用（如肾毒性、神经毒性、耳毒性和过敏反应），甚至产生抗生素耐药性。近年来，各种分析技术已被应用于抗生素残留的灵敏检测，包括电泳、酶联免疫吸附法、荧光法和高效液相色谱法，但是大多数技术仍存在操作繁琐、成本高、操作时间长等局限性。因此，需要一种简单、快速、超灵敏的抗生素检测策略。今年3月，广东省科学院生态环境与土壤研究所陈俊华等研究人员开发了一种基于血糖仪和CRISPR-Cas12a的卡那霉素（Kan）检测方案，该方案具有操作简单、成本低、便于大众使用等优点，可以实现现场检测，坚固耐用，可以在资源有限的环境下实现抗生素残留的现场检测。其线性范围为1 pM ~ 100 nM，检出限为1 pM。

01检测原理

本研究的基本思路如下：适配体与Kan相互作用释放触发C链，启动发夹组装产生许多双链DNA。这些双链DNA作为CRISPR-Cas12a的识别底物，导致Cas12a反式剪切活性被激发，切割磁珠和转化酶修饰的单链DNA。磁分离后，转化酶可以将蔗糖转化为葡萄糖，葡萄糖可以通过血糖仪进行定量（图1）。

                                                     图1.基于CRISPR/Cas12a和血糖仪检测Kan的原理

02.Kan便携式检测的可行性验证

作者在不同的条件下，研究了该方案的可行性。如图2A所示，没有目标Kan，C链在DNA1-DNA2双链中被阻断，H1和H2的组装无法发生（直方图a）。如果传感系统中不存在H1（直方图b），与直方图a相比，血糖读数没有明显变化。在缺少Cas12a的情况下（直方图c）， Cas12a介导的裂解功能无法发挥作用，血糖仪信号可以忽略不计。正如预期的那样，只有当检测系统中所有组分都完整时，才能产生血糖仪读数（直方图d）。

图2B记录了血糖仪试纸圆形对照窗口中相应的颜色变化。在所有传感元件和Kan存在的情况下，蔗糖可以通过释放的转化酶转化为葡萄糖，从而产生绿色变化，其他三个对照条件试纸的颜色保持黄色。此外，还利用PAGE实验验证了传感器的可行性。如图2C所示，上述结果表明，该传感原理对Kan检测是可行的。

图2. 基于CRISPR/Cas12a和血糖仪检测Kan的可行性分析

03.Kan便携式检测体系优化
为了获得更好的用于Kan检测的血糖仪传感器的分析结果，对C链的支点（结构域1）长度、体系的反应温度、与Cas12a的反应时间以及蔗糖浓度等实验参数进行了优化（图3）。首先对C链的支点长度进行优化，选择最佳长度8 nt，过短的话会影响链置换。考虑到最佳的信噪比（S/N），选择25℃作为最佳反应温度。90 min内血糖仪信号随着反应时间的增加而增加，90 min后响应信号停止增加，因此，Cas12a的最佳反应时间为90 min。进一步优化了蔗糖浓度，0.2-0.5 M信号值增加，0.5 M以后基本达到平台期，因此最佳浓度为0.5 M (图3)。

图3. 检测体系优化

04.Kan便携式检测体系灵敏度与特异性评估

在最佳实验条件下，研究了Kan浓度与血糖仪读数的关系。如图4A所示，随着Kan浓度的增加，血糖仪读数逐渐增加。同时记录血糖仪试纸条圆形控制窗口的颜色变化情况，随着Kan浓度的增加，条带的颜色逐渐由黄色变为绿色（图4B）。与空白样品相比，1 pM Kan可以产生明显的颜色变化，这可以定义为传感系统的检测限。如此高的灵敏度可归因于发夹DNA的循环组装过程，Cas12a的切割能力以及转化酶的多重转化效率。

图4. Kan检测灵敏度分析

以QUI、ENR、CHL、TET、EPI、LIN、STR、VIB等非靶标抗生素作为干扰分子，检测血糖传感器的特异性。Kan浓度为1 nM，对照抗生素浓度为100 nM。如图5所示，在Kan存在下，试纸条颜色为绿色，血糖仪信号高。在干扰抗生素存在的情况下，试纸的颜色仍为黄色，与空白样品几乎相同。这些结果表明，对照分子不干扰生物传感器的分析性能。该传感系统优异的特异性可归因于适配体对Kan的特异性识别。

图5. Kan检测特异性分析

05.实际样本的检测

为了证明基于CRISPR/Cas12a和血糖仪的Kan检测生物传感器的实用性，研究者检测了实际水和牛奶样品中的Kan。使用开发的生物传感器和商用ELISA试剂盒对Kan浓度分别为1、5、20、50、100 nM的水和牛奶样品进行检测。如表1所示，水样的回收率为89 ~107.2%，牛奶样品的回收率为86 ~ 106.5%。相对标准偏差（RSD）小于5%。同时，用商用酶联免疫吸附测定试剂盒对样品中Kan的浓度进行验证。血糖仪检测结果与ELISA检测结果吻合较好。相对误差（Re）在- 4.3% ~5.5%之间。这些结果表明，血糖传感器具有很强的实用性，可以在复杂的样品中工作，具有良好的准确性和可靠性。

表1. 使用传感器和ELISA试剂盒检测水样和牛奶中的Kan

总结

本文报道了一种简单、灵敏的现场检测Kan的方法，使用血糖仪作为检测器。该方案结合了CRISPR/Cas12a系统和血糖检测仪系统的优势，具有成本低、操作简单、灵敏度和特异性高的优点，可用于对复杂样品中的Kan进行现场检测。可以设想，结合CRISPR-Cas12a系统的血糖仪生物传感器可以通过简单地替换抗生素适配体，为其它抗生素的检测提供一个通用的传感平台，但不能用于多种抗生素的同时测定。ToloBio可提供Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14（Cas12f）、Cas9等多种CRISPR核心蛋白酶。

参考文献：

[1].Chen J, Shi G, Yan C. Portable biosensor for on-site detection of kanamycin in water samples based on CRISPR-Cas12a and an off-the-shelf glucometer. Sci Total Environ. 2023 May 10;872:162279. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162279. Epub 2023 Feb 16. PMID: 36801336.

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