载体是携带目的基因进入宿主细胞的运载工具，是分子克隆技术不可或缺的重要组成部分，其中，质粒是最常用的载体。面对日益繁多的质粒，正确阅读质粒图谱是进行分子克隆的前提。本文将介绍如何阅读质粒图谱。

 

一、质粒的概念及分类

1.概念

      质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1-300 kb。

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足基因工程载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建，所以目前使用的质粒多为人工改造的质粒。

理想的质粒应满足以下条件：

①复制能力：具有独立的复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增；

②表达能力：作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因； 

③稳定性高：细胞内能持续复制和表达；

④酶切位点：具有适当的限制性核酸内切酶识别和切割位点，即外源基因插入部位；

⑤遗传标记：便于重组体的筛选和鉴定；

⑥分子量小：以容纳较大的外源基因。

2.分类

（1）按功能分类:克隆载体、表达载体

       克隆载体（cloning vector）：具有克隆载体的基本元件（复制起始位点,抗性基因,多克隆位点等)，可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和扩增DNA片段或基因的载体。

表达载体（expression vector）：除了具有克隆载体的基本元件外，还有可以表达调控目的基因的元件，即转录翻译所必需的DNA序列。

（2）按受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体和穿梭载体

       原核载体（prokaryotic vector）：能在原核细胞中复制和表达的载体真核载体（eukaryotic vector）：能在真核细胞中复制和表达的载体

穿梭载体（shuttle vector）也叫转移载体（transfer vector），指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保能够在原核和真核两种宿主细胞中复制与扩增，并可以在真核细胞中有效表达。

 

二、质粒的基本元件

1.复制起点（Origin of replication，ori）

       DNA复制起始位点ori负责控制质粒复制的起始，原核生物DNA分子中只有一个复制起始位点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒；而图谱上有两个ori，则表示该质粒是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。

2.启动子（promoter, P）

       与RNA聚合酶特异性结合，促进基因转录的DNA序列。含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

真核细胞含有三类RNA聚合酶，因此真核启动子还分为I、II、III类启动。常见表达或者过表达都是II类启动子，而III类启动子如U6、H1，启动小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于构建shRNA和sgRNA载体进行敲低或敲除操作。

Ⅱ型启动子在使用特点上又可分为三大类：组成型启动子（广泛性启动子）、组织特异性启动子、诱导型启动子。

此外，不同物种的表达体系具有不同的启动子，启动子启动基因表达也有强弱之分，因此我们需要根据自己的需求选择含有相应启动子的质粒。关于启动子的详细介绍见往期推文。

3.增强子（enhancer）：增强目的基因转录

4.筛选标记（selectable markers）

       多为抗生素抗性基因，方便后续筛选阳性克隆。原核细胞筛选标记常用的是氨苄青霉素/氨苄西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四环素Tet等；真核细胞筛选标记用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。质粒图谱中用抗生素缩写+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

抗生素作用机制及用途见下表

 

5. 多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）

       外源 DNA的插入位点，通常位于启动子的下游，具有多个核酸内切酶的酶切位点，可通过酶切/连接方式将外源 DNA 插入到质粒。质粒图谱中有些酶切位点右上角标注了“*”，代表可能并不仅仅存在单一限制位点，所以一般不选用标有星号的酶切位点。

6.转录终止信号（polyA  signal）

       转录到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA会接上polyA并转录终止。常见的转录终止信号位SV40 polyA，简写为SV40 pA

7. 荧光基因

      可以用激光激发产生荧光的蛋白，一般会独立表达或和目的基因融合表达的方式被设计在质粒上，起到示踪、阳性检测、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白标签

      蛋白标签大多为较短的短肽，一般融合表达在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了标签，在缺乏针对目的蛋白的抗体时就可以很方便的对目的蛋白做检测了

9.其他调控元件

WPRE：来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件，放置在目的基因的上游，能加强目的基因的表达。

cPPT：来自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度。

 

三、如何阅读质粒图谱

以pLKO.1-Puro质粒（常用于构建shRNA载体）为例，对质粒图谱进行解读

 

1.首先看箭头方向

      质粒图谱上都会存在箭头，箭头方向可以代表转录方向如图中U6、hPGK、AmpR等启动子（白色箭头）的方向，也可以代表复制方向，即 ori（黄色箭头）的箭头方向。设计引物及插入目的基因的方向是根据转录方向（启动子方向）来定的。由于质粒是环状双链DNA，箭头可有顺时针和逆时针方向，代表两条DNA链，它的启动子在其中一条链上，而它的某些基因在另一条链上。

2.看ori鉴别质粒类型

      前文提到，若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒；而图谱上有3个ori，则表示该质粒是穿梭质粒。因此该质粒为穿梭质粒。

 

 

 

3.看启动子确定质粒的作用

       该质粒图谱中有7个启动子（白色箭头），U6启动子可用于构建shRNA和sgRNA载体；hPGK和AmpR启动子启动Puro和Amp抗性基因的表达，可用于筛选阳性克隆。T3和T7启动子分别是噬菌体T3和T7 RNA聚合酶的启动子，lac启动子是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子，RSV启动子是rous肉瘤病毒增强子/启动子。

 

4.看筛选标记/抗性基因

       图中有AmpR（氨苄西林抗性基因）和PuroR（嘌呤霉素抗性基因），AmpR用于原核细胞如大肠杆菌筛选，PuroR用于真核细胞如肿瘤细胞的筛选。当大肠杆菌和肿瘤细胞中不存在该质粒时就无法表达抗性基因，因此应用氨苄西林或嘌呤霉素可以筛选出阳性克隆。各抗生素作用机制与用途见前文。

 

5.看多克隆位点

       该质粒图谱中圆圈外围的黑体字母代表酶切位点，可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro质粒常用于构建shRNA载体，插入的shRNA靶序列位于U6启动子下游且紧邻U6启动子。针对该质粒，我们常选用AgeI和EcoRI这两个酶切位点引入外源shRNA靶序列。

 

6.看转录终止信号

       质粒图谱中pA或者poly A代表转录终止信号。

 

7.荧光标记

      有的质粒带有荧光标记，用于直观判断质粒是否转染成功。如下图所示，与pLKO.1-Puro相比，pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV启动子/增强子和EGFP序列（箭头表示），CMV启动子启动EGFP（增强的绿色荧光蛋白）的表达。其余部分与pLKO.1-Puro相差不大。

 

 

8.其他

        回到pLKO.1-Puro质粒，长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）存在于反转录病毒基因组的两端，即5’ LTR和3’LTR，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件。

cPPT来自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度。

M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物，可用于后续测序。

CAP binding site（CAP结合位点）在cAMP存在时激活转录。

HIV-1Ψ是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包装信号。 

RRE（Rev response element）允许Rev依赖的mRNA从细胞核输出到细胞质。

gp41 peptide介导HIV与CD4细胞融合，从而HIV进入细胞内。

 

想必通过上面的讲解，大家对质粒图谱的阅读应该有大致的了解，那就找几张质粒图谱练习吧。可在addgene网站（https://www.addgene.org/）搜索想要的质粒。如图：

 

庄盟生物质粒库是国内比较齐全且有完善技术售后的，相关产品链接：http://www.zomanbio.com/shengwu.php，欢迎垂询订购

抗生素相关产品

货号	产品名称	规格
M0943	潮霉素B Hyaromycin B	1g
M0942	潮霉素B（50 mg/ml）Hygromycin B (50 mg/ml)	1g
M0336	Phleomycin (20mg/ml) 腐草霉素（20 mg/ml）	20mg
M1113	Zeocin博莱霉素（100 mg/ml）	8×125mg
M2150	Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素盐酸盐	25mg
CB937	Vancomycin Hydrochloride 盐酸万古霉素	1g
M9337	Blasticidin S (10 mg/ml) 杀稻瘟菌素S （灭瘟素）（10 mg/ml）	5×10mg
M1662	Rifampicin, USP Grade  利福平	5g
M5413	Doxycycline hyclate 盐酸强力霉素	5g
M4388	Spectinomycin Hydrochloride 盐酸壮观霉素	25g
M6492	Carbenicillin, Disodium Salt 羧苄青霉素钠	25g
M0891	Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素	100g
H5570	Tetracyclin HCl 四环素盐酸盐（USP）	25g
G418	G418 Sulfate (Geneticin) 遗传霉素	5g