CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）系统是原核生物的获得性免疫系统，用于抵御外源入侵的病毒或质粒。2012 年，来自Ⅱ型CRISPR系的CRISPR相关蛋白Cas9被证明可以在体外由简单设计的向导RNA（single guide RNA，sgRNA）引导识别并切割含PAM（protospacer adjacent motif）序列的靶标双链DNA ；快Cas9又被成功应用于哺乳动物细胞的基因组编辑。从那时起，CRISPR技术在基因组编辑领域受到了高度重视和广泛应用，也连续多年被Science杂志列为“年度十大技术破”。此外，CRISPR技术也被用于基因表达调控、高通量筛选、表观遗传学工程等领域。

      核酸检测是病原菌检测、疾病检测、用药指导等领域的重要技术。虽然，目前已经开发出了许多核酸检测的方法，但更快速、更廉价、更特异、更灵敏的技术仍然是不断追求的目标。CRISPR技术无疑提供了核酸检测领域的新的解决方案，特别是基于Cas13和Cas12的反式切割（trans cleavage）或称附带切割（collateral cleavage）的活性开发的检测技术被誉为“下一代分子快速诊断技术”。

基于Cas9 的检测系统

      通过将Cas9的特异性切割特征和核酸扩增体系结合，可实现针对靶标核酸的检测，从而可实现SNP（single nucleotide polymorphism）的区分和病原体表型的分型。目前，有至少3种结合PCR扩增的检测方法被成功开发，分别为ctPCR（CRISPR-typing PCR）、CARP（Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR）和基于CRISPR/Cas9切割活性的PCR。上述方法都是在PCR扩增之前利用Cas9切割完全匹配的靶标序列，而不切割产生突变的靶标序列，从而影响PCR的扩增结果，进而区分诸如高危人乳头瘤病毒（HPV）亚型HPV16和HPV18或是用来检测低频突变。

      对于偏远地区的野外检测，常常需要无需精确循环控温仪器的等温扩增方法。结合NASBA（nucleic acid sequence based amplifi cation）介导靶标序列扩增，将Cas9、T7转录系统与基于纸质载体的等温toehold生物传感系统相结合，可实现通过肉眼观察来检测寨卡病毒的基因分型。此外，CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction）和CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method）方法，都使用了Cas9的切割与等温扩增相结合的策略，以达到针对靶标序列的单碱基分辨率。

基于反式切割活性的核酸检测

单链RNA反式切割活性的核酸检测系统

      Cas13a 是RNA引导的RNA切割酶，属于Ⅵ型CRISPR-Cas 蛋白。在gRNA的引导下，Cas13a 结合单链靶标RNA后，除了能将靶标RNA切断之外，还可激发Cas13a的“反式切割”活性，即Cas13a随机切割体系中其他的单链RNA分子。基于Cas13a的该原理，研究人员开发了SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）的检测系统。具体做法是利用RPA（recombinase polymerase amplification）或者RT-RPA等温扩增系统将目标模板扩增为包含T7启动子的DNA模板，然后再利用T7转录系统把DNA模板转变为Cas13a可以直接结合的RNA靶标；同时在体系中添加一端为荧光发光基团、一端为荧光淬灭基团的单链RNA报告分子；在Cas13a结合靶标RNA后即触发Cas13a随机切割单链RNA探针的活性，从而产生游离的荧光发光基团并发出可检测的荧光。利用该方法，研究人员灵敏地检测了各种DNA或RNA靶标，包括寨卡病毒、 登革热病毒、细菌分离株、抗性基因、人类DNA 基因型和癌症突变等。之后不久， 第二代SHERLOCKv2 系统被成功开发，其使用4 种正交的CRISPR-Cas 蛋白来实现多重靶标的检测。在此基础上，为了适应野外偏远地区的快速分子检测，研究人员进一步开发了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）方法来直接对人的体液进行快速样本处理，然后利用SHERLOCK 方法便在不到2h 内直接从患者样本中成功检测出了登革热病毒。

单链DNA反式切割活性的核酸检测系统

       除Cas13蛋白外， 来自Ⅴ 型的CRISPR-Cas12a蛋白也被发现具有反式切割特性；但与Cas13不同，Cas12a靶向DNA模板并反式切割单链DNA（singlestranded DNA，ssDNA）利用Cas12a蛋白建立的核酸快速检测方法的首次报导来自一篇2017 年提交的中国专利；后来，同一研究组在线发表了两篇研究论文，详细描述了Cas12a的切割特征和基于Cas12a的核酸检测方法，称为HOLMES（onehour low-cost multipurpose highly efficient system）。同一时期，美国一个研究组也发布了基于Cas12a的、类似的核酸检测方法，名为DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter）。无论是HOLMES还是DETECTR都展示了非常高效、灵敏和特异的检测活性，可以用来快速检测DNA病毒、RNA病毒和人的SNP。

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