解决免疫共沉淀（Co-IP）中的抗体轻重链污染问题

1.    免疫共沉淀-互作研究经典方法

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，常用于发现蛋白的互作网络、鉴定两蛋白的互作关系。

CoIP的设计原理是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可以将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。

CoIP的特点可以概括为两点，第一是天然状态蛋白，第二是蛋白复合物。

大致流程如下图所示：

2.哪有那么简单

上面讲了原理和流程，看起来很好理解。但研究中往往不像理论那么顺利。

在做CoIP实验过程中往往会遇到目的蛋白与抗体轻链（25kDa左右）或者抗体重链（55kDa左右）的分子量接近的情况，导致IP-WB检测时无法判断目的蛋白条带（如上图）。

如何解决这种问题，困扰了非常多的小伙伴。

3. 问题的根源

其实产生抗体轻、重链条带污染的主要原因是，我们上二抗的时候，PVDF膜上有两种一抗：

（1）用于CoIP的一抗脱落后跑电泳并转印到膜上（上图红圈所示）

（2）IP-WB时加入的一抗（上图红色箭头对应的一抗）。

二抗同时识别上面两种一抗，导致除了目标条带（红色箭头）外，还产生抗体的轻链和重链条带（黑色箭头）。

4. 解法

要解决该问题主要就是处理掉图中的轻、重链条带。

那我们知道做WB要有条带需要2个要素：目标蛋白、抗体及发光基团。

解法就是分别解决这3个要素，任意一个要素解决了问题就解决了。

1)  Co-IP抗体共价偶联到磁珠或者Agarose上——这样在洗脱的时候，抗体就不会被洗到CoIP产物中去。

（产品推荐：A10003 NHS-Activated Magarose Beads，或者M2001X系列Tag-Agarose beads产品）；

 2)  IP-WB检测一抗直接标记HRP，WB实验过程中不使用二抗——这样就不会发生二抗识别CoIP产物中一抗抗体。

（产品推荐：M200系列HRP标记标签抗体）；

 3)  使用一款只识别天然构象抗体的二抗——由于WB过程中，CoIP产物中一抗抗体变性，该二抗不会识别产生条带。

（产品推荐：AbSmart系列二抗）；

上述3种方法中：购买共价偶联好的Tag-Agarose beads或者HRP标记的标签抗体，使用起来很方便，作为实验首选。

但是绝大多数一抗是没有HRP标记的或者共价偶联beads的，所以很多实验室在做内源性蛋白Co-IP实验时就会很烦恼，这时候使用避免抗体轻重链的AbSmart系列二抗，就可以有效地解决这类问题，作为内源性蛋白的Co-IP实验的首选。

另外如果Co-IP之后，需要质谱鉴定互作蛋白或修饰时，为了排除质谱检测时抗体的干扰，可以选择使用NHS- Activated Magarose Beads来共价偶联一抗，然后做CoIP实验将产物进行质谱检测，这样可以大大提高质谱检出蛋白的数量和修饰位点的灵敏度。

下面给大家分享一个实验结果案例：

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1.Tag-Agarose beads产品

M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

2.HRP标记的tag产品

M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

3.避免抗体轻重链二抗产品

AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重链)

AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免轻链)

AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重链)

AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免轻链)

4.共价偶联Agarose产品

A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads

注意：

有同学反馈说使用共价偶联好的Tag-Agarose beads产品，在做CoIP-WB检测的时候，也会出现抗体轻重链。

详细了解实验流程后，发现是由于CoIP实验的最后一步（互作蛋白洗脱步骤）操作错误导致。

即很多同学在3次PBST洗涤之后，直接就加入WB Loading buffer进行煮样，然后就进行SDS-PAGE上样了。这样操作会导致共价偶联的抗体被分离下来，在WB中出现抗体轻重链的条带。

正确的操作应该是：1. 3次PBST洗涤之后，加入50-100ul的PH2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入体积根据实验需求自行调整）；2. 震荡混匀，静置30-60s，离心取上清（磁珠用磁力架）；3. 上清中按照体积比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液为PH9.0的Tris溶液）；4. 后续在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

为了方便大家实验操作，Abmart为大家提供了配置好的洗脱液和中和液产品（货号T10007），该产品也可以作为ProA/G产品的洗脱液和中和液。如果是使用Flag抗体进行CoIP实验，可以使用3*DDDDK多肽（货号T10004）进行洗脱，该产品针对非共价偶联的Flag抗体进行的CoIP实验，一样可以起到避免抗体轻重链污染的问题。