正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

游离脂肪酸，也称为非酯化脂肪酸，在与白蛋白结合的血浆中循环。动物血液中的游离脂肪酸 (FFA )含量是一项重要的生理生化指标。血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。

测定原理：

用有机溶剂萃取FFA。含有FFA的有机液与三乙醇胺铜反应,在有机相中形成脂肪酸铜 (铜皂) FFA一Cu。Cu离子与显色液反应形成紫红色络合物。反应形成的颜色深浅与Cu离子浓度的关系符合朗伯一比尔定律，因此可利用此反应进行比色。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计、离心机、可调式移液器、玻璃比色皿、蒸馏水。

样本前处理：

1.动物组织：按照动物组织质量（g）：萃取液ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml萃取液），进行冰浴匀浆。震荡提取15min，5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。

2.血清：吸取50 μl血清样本，加入1 ml萃取液，震荡提取15 min后，4℃，5000 rpm离心5 min，取有机相待测。

3.微生物、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：萃取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 ml萃取液）加入萃取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；震荡提取15 min，然后5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。

注意：有机相待测液可能存在于上层，也可能存在于下层，注意观察，体积较多的那一层即为有机相待测液。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至550 nm。

2、 工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（m）=1（ml）1（ml）：0.66（g）的比例充分混匀。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶，先将试剂一与试剂二混合，最后再加入试剂三粉剂）

3、测定管：吸取750μl样本，加入250μl工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取600μl上层有机相，加入300μl试剂四，摇匀，10 min后于玻璃比色皿中测定550 nm的吸光值，记为A测定。

4、空白管：吸取750μl萃取液，加入250μl工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取600μl上层有机相，加入300μl试剂四，摇匀，10 min后于玻璃比色皿中测定550 nm的吸光值，记为A测定。空白管只需测一次。

空白管只需测一次。△A=A测定-A空白

注意：1、有机溶剂易挥发，加入比色皿后应尽快检测。

2、测定管中加入的样本即样本前处理中的有机相待测液。

FFA含量计算：

标准曲线：y = 0.0322x - 0.0141     R² = 0.9985   x：棕榈酸标准品浓度（nmol/ml）

                                            y：吸光值差值△A

1、血清FFA含量计算：

FFA含量(μmol/ml)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =0.621×(△A+0.0141)

2、动物组织、微生物、细胞中FFA含量计算：

（1）按样本质量计算

FFA含量(μmol/g鲜重)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

                =0.031×(△A+0.0141)÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.031×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入样本体积，0.75 ml；V2：萃取液体积，1ml；V3：加入血清（浆）体积，0.05 ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：动物组织样品质量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事项：

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有机相待测液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的BCA法蛋白含量测定试剂盒。

最低检出限为10 nmol/ml。