测定意义：

土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。

测定原理：

亚硝酸还原酶可将NO₂^—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO₂^—减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

试剂的组成和配制：

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10ml蒸馏水溶解。

试剂三：液体10ml×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解；

试剂四：液体25ml×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解；

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。

自备仪器和用品：

天平、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1ml玻璃比色皿。

样品处理：

新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。

测定操作表：

计算公式：

标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R² = 0.996；x为标准品浓度（μmol/ml），y为吸光值（A标准管-A空白管）。

酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO₂^ˉ 的量为一个酶活力单位。

S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088] ×V标÷1.5562÷W÷T

= 3.084×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W

T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.2ml； W：样本质量，g。

注意事项：

1. 配制好的工作液3天内使用完。

2. 若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4. 标准曲线线性范围为0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

5. A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-3。