测定意义：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，SP）是淀粉代谢过程唯一的可逆反应酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。

在高等植物中，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于质体中，负责延长淀粉的 α-1,4-葡萄糖链的非还原末端；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于细胞质基质中，催化淀粉中的α-1,4-糖苷键磷酸解产生葡萄糖-1-磷酸，负责葡萄糖链的磷酸解，是淀粉代谢过程中的关键酶。

在植物体中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物无机磷浓度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸浓度几乎高了两个数量级，一般认为淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要测定意义。

测定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷键与无机磷反应产生葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶的作用下产生葡萄糖-6-磷酸，并在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下还原NADP+产生NADPH，使340nm下吸光值增加。

组成：

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入1.5ml水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1.5ml水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存。

自备仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定步骤：

1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm；

2、 工作液的配制：临用前按照样本量将试剂一、试剂二、试剂三按照170μl:10μl:10μl的比例混合，临用前配制，半小时内使用。

3、 在96孔板中加入10μl样本和190μl工作液，立即混匀，记录340nm处1min时的吸光值A1和6min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

SP活力单位的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T

=1286×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T

=1286×ΔA÷W

（3）按样本细胞计算

单位定义：每万个细胞每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(细胞数量 ×V样÷V样总)÷T

=2.572×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；细胞数量，500万。