测定意义：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD⁺没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

组成：

试剂三：粉剂×2瓶，－20℃保存，临用前每瓶加入9ml试剂二，现配现用。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

2、 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g， 4℃离心20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

ADH测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三在25℃水浴中保温30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μl样本上清液、160μl试剂三和20μl试剂四，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A测定管=A1-A2。

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(Cpr×V样)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(W×V样÷V样总)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1608×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷V样÷T

=1608×△A

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02 ml；V样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，1min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(Cpr×V样)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(W×V样÷V样总)÷T

=3215×△A÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=3215×△A÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷V样÷T

=3215×△A

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02 ml；V样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，1min。