正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD⁺。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD⁺降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

组成：

试剂三：粉剂×1瓶，-20 ℃保存，用时加入3ml蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1瓶，4 ℃保存，用时加入3ml蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；

自备仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

NAD+和NADH的提取：

1、 血清（浆）中NAD⁺和NADH的提取

NAD⁺的提取：按照血清（浆）体积（ml）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照血清（浆）体积（ml）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、 细胞或细菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：碱性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 加样表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样）：

充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，取200μl转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

注意事项:

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH测定中△A（A2-A1）≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2ml样本加入1ml提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD⁺或NADH.

NAD+和NADH含量的计算:

（一） NAD⁺含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.1475x + 0.0302，R² = 0.9978；其中y为△A，x为NAD⁺浓度nmol/ml

1、血清（浆）中NAD⁺含量计算

NAD⁺含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、组织、细菌或细胞中NAD⁺含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD⁺ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

（二）NADH含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.1404x + 0.0222，R² = 0.9976；其中y为△A，x为NADH浓度nmol/ml

1、血清（浆）中NADH含量计算

NADH含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆）体积：0.1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

注意：最低检测限为0.1nmol/ml或0.1nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot