正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

H₂O₂是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H₂O₂也是许多氧化应急反应中的关键调节因子。

测定原理：

H₂O₂与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。

试剂的组成和配制：

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3ml浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4℃保存；(溶解时间较长，约30min，可40℃-60℃加热，务必提前准备)

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100ml、浓盐酸5ml、研钵和冰。

H₂O₂提取：

1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；用试剂一定容至1ml；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样品的制备：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆；转移至EP管中，用试剂一定容至1ml，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至415nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂二、三和四37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

3、 在EP管中按顺序加入下列试剂。

充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：

加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值A。对照管只要做一次即可。计算ΔA＝A测定-A对照。

注意事项

1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。

2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。

H₂O₂含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.7488x + 0.0006 (x为标准品浓度，μmol/ml；y为ΔA)。

2、血清（浆）中H₂O₂含量的计算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)

3、细菌、细胞或动物组织中H₂O₂含量计算

（1）按照蛋白浓度计算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按照样本质量计算

H₂O₂含量(μmol/g鲜重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

 (3 ) 按照细菌或细胞密度计算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V2：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.3744x + 0.0006  (x为标准品浓度，μmol/ml；y为ΔA)。

2、血清（浆）中H₂O₂含量的计算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)

3、细菌、细胞或组织中H₂O₂含量计算

（1）按照蛋白浓度计算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按照样本质量计算

H₂O₂含量(μmol/g鲜重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W

 (3 ) 按照细菌或细胞密度计算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V2：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

注意：标曲线性范围为0.1μmol/ml-2μmol/ml，吸光度ΔA线性范围为0.03-1，若ΔA超过1则需要稀释，计算公式乘以相应稀释倍数。