正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

测定原理：

用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、冰乙酸50ml、甲苯50ml、研钵、冰和蒸馏水。

样品测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；之后置95℃水浴振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行匀浆；之后置95℃水浴振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。

2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（ml）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议取0.1ml血清（浆）加入1ml提取液），充分混匀，之后置95℃水浴振荡提取10分钟，10000g，25℃离心10分钟，取上清，冷却后待测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：

(1)取0.5ml样本+0.5ml试剂一+0.5ml试剂二 于有盖试管中，置95℃水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。

(2)待冷却后，在试管中加入1ml试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8ml-1ml上层溶液于1ml玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。

Pro含量计算：

1、典型回归方程y = 0.0521x - 0.0021  (x为脯氨酸含量，μg/ml；y为吸光值A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反应体系中样本体积，0.5ml；V2：加入提取液体积，1 ml；V3：加入血清（浆）体积，0.1 ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意：最低检测限为1μg/ml或1μg /g鲜重 或0.01μg /mg prot