正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

测定原理：

PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）或果汁样本的处理：

按照血清（浆）或果汁体积（ml）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议取0.1ml血清（浆）或果汁加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，95℃水浴5min充分混匀，10000g，25℃离心10min，取上清，525nm处检测测定管和对照管吸光度。ΔA=A测定管-A对照管。

注意事项

煮沸样本的操作：取300μl离心上清于EP管中，进行5min 95℃水浴处理；每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃水浴处理。

PPO活性计算：

1、血清（浆）或果汁PPO活性

单位的定义：每分钟每ml血清（浆）或果汁在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化

0.01为一个酶活力单位。

PPO（U/ml）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液

2、组织、细菌或细胞PPO活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个

酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个

酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.08ml；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1ml；V样：加入样本体积，0.18ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。