HaloTag 技术基于融合蛋白标签和合成荧光配基之间共价键的形成，可用于标记细胞或其 他生化环境中的目的蛋白以表征和分析其定位及功能。HaloTag 报告基因蛋白是 33kDa 的单体 蛋白，是一种经基因工程改造、无催化活性的水解酶衍生物，在生理条件下可以快速和 HaloTag 荧光配体形成不可逆的共价键从而实现对目的蛋白的高特异性标记[1]。此技术已经广泛应用于 哺乳动物细胞、植物、细菌、酵母和活体模式动物等生物体系。

CA-SiR Ligand 则是一款以四甲基硅罗丹明为母体的远红发射荧光配体，基于其在溶液中 无色亲酯的内酯结构和标记在 HaloTag 蛋白后荧光的两性离子结构之间的高效转换，可以实现 对目标蛋白的“免洗”标记。

CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 是以氧罗丹明为母体的荧光配体，二者皆具有良好 的荧光亮度、较高的光稳定性、较低的光毒性和较好的细胞膜渗透能力；目前已广泛应用于宽 场、共聚焦、单分子定位示踪和 SIM 超分辨成像等多种模态的成像系统中，其较好的生物相 容性使其可以应用于哺乳动物细胞、植物、细菌、酵母等生物体系的荧光成像。

相较于 CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 荧光配体，CA-SiR Ligand 荧光配体不仅具有 良好的荧光亮度、较高的光稳定性和较低的光毒性，其极佳的生物相容性和高效的细胞膜渗透能力，使得 CA-SiR Ligand 荧光配体在哺乳动物细胞、植物、细菌、酵母和活体模式动物等生 物体系中有着广泛的应用，并可在除宽场、共聚焦、单分子定位示踪和 SIM 之外的 STED 超 分辨成像体系中进行活细胞荧光成像。

 3.实验步骤

3.1  在 CA-SiR Ligand 中加入 50 μL/5 μL 新鲜干燥的 DMSO，混合均匀，得到 1 mM 母液。

3.2 将培养基预热至 37 ℃，将 CA-SiR Ligand 母液按照 1000- 5000 倍稀释比例加入到预热的 培养基中，稀释后的染液建议尽快使用，久置后可能导致部分染料分解或沉淀。

3.3 吸去已经表达 Halo-tag 蛋白细胞的培养基，更换为稀释好的培养基染液，在培养箱中孵育

5-15 分钟后即可在不更换培养基的情况下进行“免洗”荧光成像。也可以对用预热的培养基 清洗细胞一至两次后用于荧光成像。

注：1、我们建议对大多数细胞系使用 200-250 nM，如 HeLa、COS7、U-2OS 等；对组织或活 体动物染色使用 500-1000 nM。

2、不同样品染色条件有所差异，建议起始染色方法为 1000 倍稀释，15 分钟染色，请根 据实际染色效果进行调整。

3、CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 细胞渗透性荧光配基的实验步骤类同上述实验操 作。

 4.参考文献

1. Los, G. et al. "HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and  protein analysis." ACS Chem. Biol., 2008, 3, 6, 373-382.