Un1Cas12f1 (Cas14a1) CRISPR酶
| 货号 | 32119-01/32119-03 | 售价（元） | 1300/5500 |
| 规格 | 100 pmoL/1000 pmoL | CAS号 |
- 产品简介
- 相关产品
产品信息
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
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32119-01 |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
100 pmoL |
1300 |
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32119-03 |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
1,000 pmoL |
5500 |
产品简介
Un1Cas12f1(又名 Cas14a1)是一种内切核酸酶，其在 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)的引导下，特异结合并切割靶标 ssDNA，且不受 PAM 位点的限制。此外，Un1Cas12f1 也能以 PAM 依赖的方式特异地剪切靶标双链 DNA，使 DNA 双链断裂并生成粘性末端。与其他 Cas12 蛋白类似，Un1Cas12f1 蛋白同样拥有针对ssDNA 的反式切割活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，双链或单链 DNA 靶标均能激活 Un1Cas12f1 的反式剪切活性，即当 Un1Cas12f1 蛋白与 sgRNA、靶标 DNA 结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列 ssDNA 的反式剪切活性，将体系中的任意序列 ssDNA 切碎。
相比于其他的 Cas 蛋白，Cas12f1 蛋白的分子量普遍较小(400~700AA)，其中 Un1Cas12f1 的分子量约61.5 kD，可用于靶标核酸的分子检测(详细信息请参考 PMID: 30337455)。
产品组成
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组分 |
32119-01 (100 pmol) |
32119-03 (1000 pmol) |
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Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a |
100 pmol |
1000 pmol |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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Control Target ssDNA and sgRNA (10 μM) b |
5 μL |
5 μL |
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ssDNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM) c |
5 μL |
5 μL |
a. Un1Cas12f1 Nuclease 浓度为 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 规格的总体积为 10 μL，1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL；
b. Control Target ssDNA and sgRNA 应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在 6 个月内使用，使用时建议取 0.5 μL 至每 20 μL 反应体系；
c. ssDNA Reporter (FAM-BHQ1)应避光保存，使用时建议取 0.5 μL
保存条件
Control Target ssDNA and sgRNA 于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
活性定义
在总体积为 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min 内切割 1 pmolssDNA 探针所需的 Cas12f 酶量定义为 1 transU。
例：若某批次 Un1Cas12f1 酶的反式切割活性为 0.7 transU/pmol，则表明 1 pmol 的该批次 Un1Cas12f1酶可在 1 min 内，在上述指定的反应条件下，反式切割 0.7 pmol ssDNA 探针。本公司提供的 Cas 酶 transU数值详见各批号的 COA 检测报告。
实验流程
1. 反式切割实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 µM Un1Cas12f1 Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM Target DNAd |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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d. 反式剪切体系中 Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，Un1Cas12f1 Nuclease 可用 1× HOLMES Buf er 1 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的 Cas12 酶长期保存，请使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释，但极低浓度的 Target DNA（例如 LOD 实验）建议用 0.1% Tween 20 稀释
并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
*反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas 酶transU的具体数值，详见本公司提供的 COA检测报告。
实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号，37℃反应，每 30 sec 采集一次荧光信号。
实验结果
注意事项
1. Cas12f 的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12f 在 sgRNA 的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA 靶标需带有 PAM 位点，而 ssDNA 靶标不依赖 PAM 位点。
2. 当 Un1Cas12f1 结合靶标 ssDNA 时，需使用 T7 核酸外切酶对扩增富集生成的靶标 dsDNA 进行处理，且其中一条扩增引物需要采用磷硫酰化修饰以确保 T7 核酸外切酶仅切割其中一条链，从而留下ssDNA 靶标链以用于 Un1Cas12f1 介导的分子检测。此外，也可以用非对称 PCR 的方法进行扩增，以获得靶标 ssDNA(详细信息请参考 PMID: 30337455)。
3. Jennifer Doudna 团队的研究表明，Un1Cas12f1 只能识别和切割 ssDNA 靶标(详细信息请参考 PMID:30337455)；然而 Virginijus Siksnys 团队的最新研究成果则证明，Un1Cas12f1 同样具有 PAM 依赖型dsDNA 靶标的识别和切割能力，且不同 Cas12f 的 PAM 序列稍有不同，但均富含 T(详细信息请参考PMID: 32246713)。
4. Cas12f 的反式剪切(trans-cleavage)：当 target DNA 存在时，Cas12f/sgRNA 与 target DNA 形成三元复合物(Cas12f/sgRNA/target DNA)，同时，Cas12f 被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链 DNA切碎。
5. 因为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。
6. Un1Cas12f1 酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
7. 本产品仅供科研使用。