产品信息：

产品简介

        Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商业名称，其中文名称博来霉素是一种铜离子螯合的糖肽抗生素（来源于链霉菌Streptomyces verticillus的突变株），铜离子的存在使其呈蓝色，此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后，二价铜离子（Cu2+）被还原为一价铜离子（Cu+），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。博来霉素是作用谱广泛，对细菌、真核微生物、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。博来霉素常用作一种非常有效的工具抗生素，用来筛选携带Sh ble抗性基因并能稳定表达分子量为13.665 kDa的一种博来霉素抗性蛋白的细胞株。博来霉素是的用量为 50-2000 ug/ml（通常 300 ug/ml），具体取决于细胞类型。

提供无菌溶液形式的Zeocin，浓度是100mg/ml，使用起来更加方便，只需直接加入培养基到所需工作浓度即可。

产品性质

分子式（Formula）：C55H85O21N20S2Cu - HCl

Cas: 11006-33-0

分子量（Molecular Weight）：1535

外观（Appearance）：蓝色粉末

内毒素：＜1 EU/mg

纯度（Purity）：>90%(HLPC)

溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

应用参考浓度：

1）大肠杆菌筛选：25-50μg/mL（低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L）

2）酵母菌筛选：50-300μg/mL（YPD或基本培养基）

3）哺乳动物细胞筛选：50-1000μg/mL（合适培养基，根据细胞系而不同）

使用步骤参考

一、细胞对Zeocin敏感性的确定（杀灭曲线建立）

重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24h，去除旧培养基。

加入含不同浓度Zeocin的筛选培养基，Zeocin浓度可设置为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。

每3-4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适时间（1-2周内）杀死大多数细胞的浓度为最加工作浓度。【注】：若是难以在显微观察下区分活细胞，建议使用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定Zeocin的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞系

转染细胞，用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

转染后，用预热的1X PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。

转染48-72h后，用含有最加浓度Zeocin（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，按照以下方法克服此类耐性：用含Zeocin培养基进行细胞分盘，置于37°C孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C，2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。

每3-4天更换新鲜的选择培养基，直到出现细胞集落。

挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。

三、稳定转染细胞系的维持培养

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞：

1）使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养；

2）降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养；

3）使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【根据杀灭曲线来判断】。