产品信息

产品简介

      Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之间的差异在 RNA 5'端第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基，在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1 结构提高了 mRNA 的翻译效率。mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase 能在 RNA 5´末端紧邻帽结构的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团，利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，使带帽 Cap 0 甲基化为 Cap 1。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 为底物，不会作用于 5´末端为 pN、ppN、pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构（m7GpppN）的 RNA 可通过近岸蛋白质 Vaccinia Capping System（货号: M062）获得。
     
         图1. mRNA 帽结构 2´ -O-甲基转移酶作用机理。mRNA 的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0 结构由相邻的 RNA 链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成 cap-1 结构需要 2′-O-甲基转移酶的参与，该修饰可以降低 RNA 在体内引起的细胞先天免疫反应。本图引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65. 
      本体系可用于 IVT RNA 的加帽反应，使加帽反应在 1h 之内完成，效率接近 100%。IVT 推荐使用近岸蛋白质 T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。 
产品用途：
提高RNA的翻译效率；
改善mRNA在显微注射和转染后的表达。
注意事项：   
SAM：需事先计算好 SAM 的用量，在反应开始前把分装的 32 mM 的储备液稀释成2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免 SAM 降解，该工作液需要保存于冰上。 
Cap 0-RNA 的制备：IVT RNA 需进行纯化并溶解于 RNase-free 水中，不能将 RNA 溶解在 EDTA 溶液或其他盐溶液中。Cap 0-RNA 可通过近岸蛋白质 Vaccinia Capping System（货号：M062）反应体系获得。为减少反应步骤，也可通过在同一体系内添加两种酶直接获得 Cap1-RNA，该反应基于近岸蛋白质 Cap 1 Capping System（货号：M082），试剂盒内涵盖 Vaccinia Capping System和 mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase。 
RNA 二级结构：一些 RNA 转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的 5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热 RNA 可以去除转录产物 5´端的二级结构，如果转录产物的 5´端结构复杂，可以把加热时间延长至 10min。 
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白质 E. coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在进行 RNA 转染实验前做纯化处理。 
RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入 0.5 µl 近岸蛋白质 RNase 抑制剂（货号：E125），同时去掉等体积的 RNase-free 水。 
相关产品：
For research and manufacturing use only.