产品信息

货号	名称	规格
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
GMP-M072-01A	mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase, GMP Grade	2500U
GMP -S062	SAM (32mM), GMP Grade	0.5ml
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
M062-YH01-01A	Vaccinia Capping System	500U
M072	mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase	2500U/2500U×5
M082	Cap 1 Capping System	10T/100T

产品简介

      牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的（图1）。
      由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。


     图1. 参与mRNA 加帽的酶促途径。Cap 0 结构 RNA 的产生需要牛痘病毒加帽酶：该酶兼具三磷酸酶、鸟苷转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基供体。一旦产生了Cap 0 结构，就可以通过2'-O-核糖甲基转移酶进一步修饰以产生Cap 1 结构。本图引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 

     本体系可用于 IVT RNA 的加帽反应，使加帽反应在 1h 之内完成，效率接近 100%，并且保证正确的方向。IVT 推荐使用近岸蛋白质 T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。 
产品用途：
体内或体外翻译前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端标记。 
提高 RNA 的翻译效率； 
改善 mRNA 在显微注射和转染后的表达。 
应用实例：

注意事项：   
SAM：SAM 在pH 7-8，37°C条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免 SAM 降解，该工作液需要保存于冰上。 
RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的 RNA 进行纯化并溶解于 RNase-free 水中，不能将 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他盐溶液中。 
RNA 二级结构：一些 RNA 转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的 5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热 RNA 可以去除转录产物 5´端的二级结构，如果转录产物的 5´端结构复杂，可以把加热时间延长至 10min，加帽反应时间可延长至 60min。 
Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之间的差异在 RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1 结构提高了 mRNA 的翻译效率。

Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白质 E. coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在进行 RNA 转染实验前做纯化处理。 
RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入 0.5 µl 近岸蛋白质 RNase 抑制剂（货号：E125），同时去掉等体积的 RNase-free水。 
For research and manufacturing use only.