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中国医学科学院郭斐团队建立猴痘病毒快速精准检测方法

20225月起,猴痘疫情在世界范围内迅速传播,截至2023106日,已有115个国家向世卫组织报告了9万余例确诊病例和157例死亡病例。20236月以来,我国多个省份先后报告1000余例猴痘确诊病例,引发新增本土续发疫情和隐匿传播的较高风险。
        猴痘是由猴痘病毒MPXV引起的人畜共患病,与天花病毒VARV牛痘病毒CPV痘苗病毒VACV同属痘病毒科正痘病毒属。自20世纪80年代在世界范围内根除天花后,MPXV成为人类最关注的正痘病毒。由于正痘病毒属表面蛋白具有较高的同源性>90%,以VACV或改良牛痘病毒为基础的天花疫苗产生的中和抗体可以持续数十年,对猴痘提供约85%的交叉保护作用。
       然而,自从世卫组织1980年宣布消灭天花后,大多数国家终止了常规的天花疫苗接种,导致全球范围内相当一部分人群对猴痘病毒缺乏免疫力。此外,在接种天花疫苗的人群中,其保护作用也会随着时间的推移而缓慢衰减,从而增加了感染猴痘病毒的风险。
      鉴于国内的猴痘疫情和快速增加的猴痘病例,需要在发病早期快速甄别出阳性病例,并指导后续的防治策略和疫情防控。猴痘病毒的检测可通过病毒培养和分离鉴定、电子显微镜、聚合酶链反应PCR、免疫荧光检测等技术方法进行。猴痘病毒培养和分离鉴定为确证试验,但猴痘的培养只能在生物安全III级实验室由受过相关安全程序培训的具有相应准入资质、并具有丰富病毒分离培养经验的人员进行,但病毒分离阳性率低,需耗时数天。不建议将病毒分离作为常规检测和诊断程序。电子显微镜可用于评估样本中潜在的猴痘病毒。但电子显微镜需要专门的专业技术人员,技术要求较高,且对样本中病毒颗粒的浓度要求较高。
因此,由于所需的高技术技能和设施,这种方法并不常规用于猴痘病毒的检测。其他检测方法,如血清中和试验、凝胶沉淀、免疫荧光试验等,虽然也具有一定的诊断价值,但操作复杂,耗时长,不适合作为猴痘病毒的常规实验室检测。
      目前,聚合酶链反应PCR检测是首选的猴痘检测方法,其中实时PCRqPCR技术是猴痘病毒检测和分型最有效的方法。该方法的优点是灵敏度高、通量大。但目前针对猴痘的PCR检测试剂存在检测时间长、稳定性差、操作繁琐、与其它正痘病毒存在交叉反应的风险等缺陷。而且,猴痘病毒感染潜伏期较长,实时荧光定量PCR分子诊断方法对样品采集、实验操作人员及配套检测设备有较高要求,无法保证快速鉴别感染者。目前没有可以广泛使用的商业 PCR检测试剂盒。因此,针对猴痘病毒有效的快速、灵敏、精准的检测方法亟需建立。
      20231016日,中国医学科学院病原生物学研究所郭斐课题组在 Cell Reports Methods 期刊发表了题为:Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究论文。
该研究建立了一种快速精准的猴痘病毒检测方法,通过将等温扩增RPACRISPR-Cas12a的检测体系联合,可以实现猴痘病毒DNA30分钟内的快速检测,检测灵敏度1个拷贝数,同时能够精准区分其他正痘病毒以及猴痘病毒,具有良好的实用价值。

研究团队首先设计了两个crRNA的检测体系池,其中一组靶向正痘病毒(包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘)的保守区D6RE9L,可以检测所有的正痘病毒;另外一组靶向猴痘病毒特有的区域N3RN4R。通过对crRNA的设计和筛选,建立了基于CRISPR/Cas12a的荧光报告体系(图1