CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是一段成簇、规则间隔的短回文重复序列。其与CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于多数细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统。

CRISPR/Cas系统主要通过适应，表达和干扰三个阶段来介导细菌的免疫过程（见图1，图片来自Barrangou, R. and Marraffini, L. Molecular Cell .2014.）。首先，在适应阶段，与病毒或质粒序列同源的DNA短片段会被整合到CRISPR的间隔区；在表达阶段，CRISPR基因序列的一级转录本pre-crRNA产生，并被加工成crRNA，crRNA与病毒或质粒的靶序列匹配；在干扰阶段，crRNA将Cas蛋白引导至与间隔区匹配的病毒或质粒处形成效应复合物，并利用Cas蛋白切割靶序列。其中，PAM序列是crRNA引导Cas蛋白正确识别靶序列的必要条件。

                               图1

法国科学家Emmanuelle Charpentier在对化脓性链球菌的研究中发现了tracrRNA，并且2011年开始与Jennifer Doudna合作。Doudna是一位经验丰富的生物化学家，对RNA有着丰富的知识。她们一起成功地在试管中再造了细菌的基因剪刀，并简化了剪刀的分子组成，使其更容易使用。两个人因为发现CRISPR/Cas9基因编辑技术而获得2020年诺贝尔化学奖。其实还有一些生物学家对基因编辑技术做出了很多贡献，例如华人科学家张锋首次证明CRISPR基因编辑可用于真核生物中。

之后大家继续思考，既然crRNA可以引导Cas蛋白特异性识别靶序列，那CRISPR技术是否也可以应用于核酸检测中？答案是肯定的。随着对CRISPR/Cas系统研究的不断深入，Cas蛋白的特点及功能活性被逐渐认识并应用，并且发现了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定义并命名。表1中列出用于分子诊断的CRISPR/Cas系统及其特点。其中可以看到，Cas12a主要靶向单链或双链DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

                               表1

2018年，Chen等研究发现当CRISPR/Cas12a蛋白以序列特异性的方式切割dsDNA时，会诱发强烈的、非特异性ssDNA 的反式切割。作者利用Cas12a 这一附属切割活性开发了一种准确快速的检测方法。该检测方法将Cas12a 与等温扩增相结合，命名为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并实现患者样品中人乳头瘤病毒(HPV)高灵敏检测。

从样本中提取HPV的DNA，通过重组聚合酶等温扩增对DNA进行扩增，再将Cas12a-crRNA复合物和标记有荧光淬灭的单链DNA探针加入反应体系。当Cas12a-crRNA复合物特异性结合并切割HPV的DNA时，激活Cas12a的非特异反式切割，即对单链DNA探针进行切割，ssDNA荧光基团在被切割后产生荧光信号并完成对样本中HPV DNA的特异性检测。DETECTR可以对样本中HPV16和HPV18进行准确检测，相关原理示意图见图2。对25个样本进行DETECTR检测结果与普通PCR检测进行对比，结果完全符合。

                      图2

LwCas13a是第一个被用于核酸检测中的Cas13a蛋白。Gootenberg等开发的基于Cas13a蛋白的检测技术与等温扩增技术结合，既可以检测DNA靶标，也可以检测RNA靶标。该技术被命名为SHERLOCK (Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。检测原理如图3-a，由于Cas13a识别RNA靶标，所以RPA扩增后需要将产物转录为RNA，后面的过程与DETECTR相似，Cas13a-crRNA特异结合RNA靶标后，Cas13a的非特异性反式切割活性被激活，对周围的荧光探针进行切割从而发出荧光进行检测。

2018年Gootenberg等对SHERLOCK技术进行升级，可以实现在单个反应中检测3 个ssRNA 靶标和1 个dsDNA靶标。研究人员对17 种CRISPR/Cas13a 和/Cas13b 酶进行了生化鉴定，选择了3 种具有不同切割偏好的Cas13 蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)与Cas12a 和RPA结合使用，每一种扩增的核酸靶标与对应的Cas-crRNA 相结合，可激活对应Cas蛋白的活性而切割其对应的特异性底物，从而产生多种不同的荧光响应，实现对不同靶标的检测。相关原理见图3-b。

                                    图3

但是根据上面的应用可以看出，CRISPR/Cas技术通常需要与等温扩增等技术一起使用才能完成检测，需要RPA对目标靶标扩增后，CRISPR/Cas主要发挥的是特异性检测的作用，是否可以不经RPA等技术扩增而直接利用CRISPR技术进行核酸检测呢？很多学者也在这方面进行了各种探索。

Hajian等在2019年开发一种CRISPR芯片，该芯片材质基底为石墨烯，利用场效应晶体管与CRISPR/Cas系统结合来检测是否有目标序列的存在。石墨烯芯片上预制许多CRISPR/dCas9分子复合物。其中dRNP复合体可以解旋双螺旋DNA，并且扫描整条DNA链，如果发现目标序列，dRNP复合体就可以调控场效应晶体管来输出电信号完成检测。但是整个芯片的检测成本较高。相关示意图见图4.

                                      图4

2019年，Dai等通过探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要开发一种通用的电化学传感器。如图5所示，Cas12a既有crRNA介导的特异性的顺式剪切（cis-cleavage），也有非特异性的反式剪切活性（trans-cleavage）。图5B中结合有亚甲基蓝燃料的非特异的单链DNA报告分子被固定在金电极上。如果存在目标分子，Cas12a-crRNA就会介导对非特异ssDNA报告分子的反式剪切，产生较低的电化学信号；而如果没有目标分子存在，Cas12a-crRNA不会激活其反式剪切活性，报告分子不会被切割，就会产生比较高的电化学信号，以此来判断是否存在目标序列。

                                                                              图5

CRISPR技术在核酸检测中优点主要有：

1）对单碱基突变有很高的分辨率；

2）更高的特异性和灵敏度；

3）陆续发现新的更有价值的Cas蛋白，可以更特异以及准确的进行分子检测。

但是同时也有相应的局限性：

1）设计时在3’端需要合适的PAM序列，PAM序列使crRNA引导Cas蛋白正确识别靶序列的必要条件；

2）目前在多重检测中还有许多限制；

3）目前大部分都是与RPA等扩增技术联合使用，但是扩增也可能会引入误差，同时也有污染的风险。

CRISPR/Cas技术在核酸检测中发挥了重要作用，为核酸检测提供了新的思路。未来的研发方向主要是更加流程化，减少中间的操作步骤，使得检测更加快速和便捷。随着基于CRISPR/Cas技术的核酸检测平台的不断发展，未来在分子诊断方面将发挥更重要的作用。

参考文献

1.周桓等，Acta Microbiologica Sinica，2021,61(12):3856-3869.

2.Chen, et al. Science. 2018; 360(6387):436-439.

3.Gootenberg, et al. Science. 2017;356(6336):438-442.

4.Gootenberg, et al. Science. 2018; 360: 439-444.

5.Liu, et al. Lab Chip, 2023, 23, 1467–1492.

6.Hajian, et al. Nat Biomed Eng. 2019; 3(6): 427-437.

7.Dai, et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2019; 58(48): 17399-17405.

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