猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒，主要通过呼吸道飞沫、体液、分泌物、伤口或病毒污染物进行传播。人感染猴痘会出现发热、头痛、全身酸痛、咳嗽、淋巴肿大等症状，还可能并发细菌感染、败血症、肺部感染、呼吸窘迫综合症等。阻断猴痘病毒的传播主要以预防为主，同时对病原检测及时发现病毒阻断病毒的传播显得十分重要。一般来说，qPCR是猴痘病毒首选的实验室检测方案，但从对抗新冠疫情中得到的经验教训表明，预防突发大流行的源头是向个人提供快速可靠的即时诊断工具，抗原检测在新冠病毒检测中扮演了这一角色，但也暴露出抗原检测的准确度仍亟待提升的问题。对于猴痘病毒，其抗原的低特异性使其更容易导致假阳性结果，因此猴痘病毒的即时诊断难以通过抗原检测的方式实现。

近日，一项发表于《Sensors and Actuators B: Chemical》的研究介绍了一款特殊的猴痘病毒检测装置，该装置包含了以RPA和CRISPR-Cas12a技术作为原理的冻干型检测试剂，可在35分钟内完成对猴痘病毒的快速自测。

01RPA-CRISPR/Cas12a检测猴痘的策略

该检测的原理首先利用了RPA法对猴痘病毒核酸指数级扩增的能力，将得到的扩增产物与预先设计好的gRNA和Cas12a酶组成的RNP复合物结合，RNP复合物与猴痘病毒特异性扩增产物的相互作用激活了Cas12a酶的反式切割活性，导致ssDNA报告探针被切割而产生可检测的荧光。另外，RPA和CRISPR/Cas12a的反应体系具有很好的兼容性，这种集成的RPA-CRISPR/Cas12a反应可以在单一的温度和单个试管中进行，避免了气溶胶污染的风险，并且提高了检测的灵敏度和特异性（图1）。

图1.CRPA-CRISPR检测猴痘病毒的基本原理

02CRISPR 解决恒温扩增非特异的困局

研究人员选取了猴痘病毒的B6R和F3L基因作为检测的靶标，并针对这两个基因筛选了多对RPA引物。尽管如此，在对模拟样本进行独立RPA扩增测试的过程中仍出现了较多的非特异性扩增，这与RPA方法的扩增原理相关。为了解决检测过程中非特异性扩增的问题，研究人员尝试将CRISPR-Cas12a核酸检测技术与RPA方法相结合，并分析相同的样品。结果证明该方法使检测的特异性得到了明显的提升，CRISPR-Cas12a识别了RPA扩增子的特定序列，并将其与非特异性扩增的产物区分开来（图2）。

图2. RPA与CRISPR技术相结合的必要性

03基于CRISPR的猴痘病毒POCT检测装置

在成功开发了RPA-CRISPR / Cas12a检测方法后，研究人员将所有试剂进行冻干并集成到一个便携式的MASTR袋中以检测猴痘病毒。MASTR 袋中的主要组件包括迷你移液器、即用型管、采样管、迷你移动电源、自动读出装置和迷你恒温加热块，通过检测在RPA-CRISPR/Cas12a部分的同一批次样品来验证MASTR袋的可行性，用于检测质粒和病毒。测试结果表明，阳性结果发出明亮的荧光，阴性结果仅存在较低的背景信号；证明 MASTR 袋具有便携和操作简单的特点，且没有假阳性的结果（图3）。

图3. 基于RPA-CRISPR冻干试剂的即时诊断装置

研究人员还使用MASTR袋测试了各种类型的模拟临床标本，结果表明MASTR袋拥有与qPCR实验室测试相当的特异性与灵敏度，证明了MASTR袋检测猴痘病毒的准确性（图4）。

图4. MASTR袋的性能验证 

尽管如此，该研究在也存在一定的局限性，主要体现在未能获得并检测真实的猴痘临床标本，但这与当前猴痘患者的总体数量稀少相关。不可否认的是，这款RPA-CRISPR冻干型装置在猴痘病毒的即时检测方面具有较大的潜力，有望通过早期疾病的检测来帮助防控猴痘疫情。 

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