AapCas12b (C2c1) CRISPR酶
| 货号 | 32118-01/32118-03 | 售价 | 1260/6280 |
| 规格 | 100 pmoL/1000 pmoL | CAS号 |
- 产品简介
- 相关产品
产品信息
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
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32118-01 |
AapCas12b (C2c1) |
100 pmoL |
1260 |
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32118-03 |
AapCas12b (C2c1) |
1,000 pmoL |
6280 |
产品简介
AapCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是由 tracrRNA:crRNA(或 sgRNA)介导的 DNA 核酸内切酶，在靶标双链DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情况下，特异地剪切靶标双链 DNA，使 DNA 双链断裂并生成粘性末端。而AapCas12b 特异地剪切单链 DNA 靶标不依赖 PAM 序列。此外，双链或单链 DNA 靶标均能激活 AapCas12b的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当 AapCas12b 酶与 sgRNA、靶标 DNA 结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列 ssDNA 的反式剪切活性，将体系中的任意序列 ssDNA 切碎。
AapCas12b 来源于嗜酸耐热菌 Alicyclobacillus acidiphilus，最佳剪切反应温度为 60℃，比 AacCas12b(#32116)更耐高温。因此，相比于 AacCas12b，AapCas12b 更适用于与 LAMP 联用，开发“一步法”恒温扩增/CRISPR-Cas 检测体系(详细信息请参考 PMID: 32937062)。
产品组分
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组分 |
32118-01(100 pmol) |
32118-03 (1000 pmol) |
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AapCas12b Nuclease (10 μM)a |
100 pmol |
1000 pmol |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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Control Target DNA and sgRNA b |
5 μL |
5 μL |
a. AapCas12b Nuclease 浓度为 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 规格的总体积为 10 μL，1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL；
b. Control Target DNA and sgRNA 应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在 6 个月内使用，使用时建议取 0.5 μL 至每 20 μL 反应体系。
保存条件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
活性定义
在总体积为 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，60℃反应条件下，1 min 内剪切 1 pmolssDNA 探针所需的 Cas12b 酶量定义为 1 transU。
例：若某批次 AapCas12b 酶的反式剪切活性为 6.0 transU/pmol，则表明 1 pmol 的该批次 AapCas12b
酶可在 1 min 内，在上述指定的反应条件下，反式剪切 6 pmol ssDNA 探针。本公司提供的 Cas 酶 transU
数值详见各批号的 COA 检测报告。
实验流程
1. 顺式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AapCas12b Nuclease |
0.5 μL |
250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.5 μL |
250 nM |
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1 μM Target DNAc |
0.5 μL |
25 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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c. 顺式剪切体系中 Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA。
l*若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用 dsDNA靶标，因为 ssDNA靶标会被反式激活的 Cas12b 进一步切碎。对于 20 μL 顺式剪切应体系，推荐 target DNA的使用量为 100 ng～500 ng，且 target DNA片段长度在 300 bp～3 kb 范围内。不同长度 target DNA需要的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根据 target DNA的摩尔量计算，建议保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为 10:10:1，以尽量确保 targetDNA被剪切完全。
60℃反应 30 min~1 h，85℃灭活 5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
2. 反式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM AapCas12b Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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1 μM Target DNAd |
0.5~5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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d. 反式剪切体系中 Target DNA 可为 ssDNA 或带 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AapCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的 Cas12 酶长期保存，请使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释，但极低浓度的 Target DNA（例如 LOD 实验）建议用 0.1% Tween 20 稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
*反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas 酶transU的具体数值，详见本公司提供的 COA检测报告。
实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号，60℃反应，每 30 sec 采集一次荧光信号。
实验结果
注意事项
1. Cas12b 的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA 靶
标需带有 PAM 位点，而 ssDNA 靶标不依赖 PAM 位点。
2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：当 target DNA 存在时，Cas12b/sgRNA 与 target DNA 形成三元复合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同时，Cas12b 被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链 DNA切碎。
3. 利用本产品的反式剪切活性进行分子诊断实验，可参考本公司的 HOLMESv2[1]体系。
4. 为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。
5. AapCas12b 酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
6. 本产品仅供科研使用。
参考文献
[1] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation[J]. ACS Synthetic Biology. 2019, 8(10): 2228-2237.