重组酶聚合酶扩增技术的发展 - 行业新闻 - 南京沃博生物科技有限公司

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重组酶聚合酶扩增技术的发展

浏览：发布日期：2024-7-12 10:10:49

自1983年经典的聚合酶链反应(PCR)方法问世以来，核酸扩增技术已渗透到生命科学的各个领域。然而，尽管它的基本范围，PCR一直被限制在实验室的墙壁内，由于它需要一个复杂的热循环机器，限制了在低资源环境下的外部应用。新的等温扩增策略正在寻求突破传统的实验室界限，提供恒温核酸复制。在这些方法中，重组酶聚合酶扩增(RPA)是发展最快的方法之一，尽管它的引入相对较晚，但它的吸收和市场发展也很快。至关重要的是，RPA的技术增强了实验室外高度可获取和敏感的核酸扩增，甚至是自我检测。在这里，我们全面回顾了RPA在其发展的第一个十年中的无设备简单性。本文综述了RPA技术的关键知识，如其反应成分、机理、灵敏度和特异性以及独特的检测方法。该综述还提供了开发RPA分析的技术诀窍，以及有关商用RPA反应试剂盒和附件的信息。通过对已发表文献的数据挖掘，我们总结了关键的RPA实验提示和问题，以帮助研究人员掌握RPA反应。我们还概述了RPA发展的影响力的热点，并展望了未来的发展前景以及对超越PCR和进一步革新生命科学的影响。

简介及概述

体外核酸扩增(NAA)是遗传物质的人工复制，已渗透到生命科学和生物技术的各个领域，如病原体检测、癌症研究、克隆、测序、基因工程、合成生物学、基因分型、诱变、犯罪法医鉴定、药物发现、分子考古学、食品检测、健康和生活方式检测等。这场爆炸性的革命始于1983年Kary Mullis发明的聚合酶链反应(PCR)。从根本上说，PCR是一个循环过程，通过提供有利于核酸复制过程的连续温度(链变性、引物退火和酶延伸)，从单个核酸分子到体外数十亿拷贝进行指数扩增。分子数量的增加使得核酸的处理和后续应用变得更加容易，减少了使用有毒放射性探针来跟踪分子存在的需求，并在应用方面产生了巨大的创造力。然而，尽管PCR很有价值，但需要一个复杂的热循环器来提供循环加热和冷却过程，这在很大程度上限制了PCR在实验室墙壁内的实施，阻碍了其在低资源环境中的应用。

核酸等温扩增技术的最新进展为人工核酸复制提供了简化的孵育条件，只需要恒温而不需要热循环。单温孵育减少了对设备的要求，为突破实验室的界限开辟了新的途径，并在资源匮乏的环境中进行扩增。通过减少放大时间，消除重复加热和冷却步骤也为低资源实施提供了第二个优势。更快的反应发生不仅是因为加热和冷却时间的减少，而且还因为多个分子反应可以异步进行，而不是被迫在人工加热和冷却循环中依次进行。自20世纪90年代初以来，大量的等温核酸扩增方法采用了各种反应机制。最完善的方法包括基于核酸序列的扩增(NASBA，也称为转录介导扩增，TMA)、核糖核酸(RNA)技术的信号介导扩增(SMART)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、多重位移扩增(MDA)、环介导等温扩增(LAMP)和链位移扩增(SDA);读者可以在一些评论中参考这些方法的细节。2-5特别是重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，由于其设备要求简化和反应时间快，尽管其引入相对较晚，但其发展迅速，市场份额不断增加(图1)。

RPA最早是在2006年由来自ASM科学有限公司(英国剑桥，由Wellcome Trust Sanger研究所创立)的Niall Armes引入的虽然在等温核酸扩增技术中，RPA尚未占据较大的市场份额百分比(根据大观研究报告的数据，图7)。1A)，它正经历着最迅速的吸收。到目前为止，已经出版了250多份关于RPA的出版物，在过去六年中，RPA出版物的数量持续增加;值得注意的是，RPA出版物数量从2014年开始呈指数增长(图1B)。其中，2014 - 2018年连续发表了5篇RPA综述论文。Zaghloul和El-shahat的综述侧重于RPA在丙型肝炎病毒诊断中的应用;Moore和Jaykus的综述强调了用于检测肠道病毒的RPA分析;James和Macdonald,10 Daher等人11和Lobato和O' sullivan的综述12描述并总结了RPA在护理点(POC)诊断中应用的特点和优势。在此，我们对RPA的自由基性质和发展潜力进行了综述。首先介绍RPA技术的关键方面，即反应成分和机制。随后，我们提供开发RPA分析的专业知识，包括设计和选择寡核苷酸(引物，探针和模板);还提供了有关市售RPA反应试剂盒和附件的信息。对于那些对RPA的技术实现感兴趣的人，我们通过数据挖掘已发表的文献总结了关键的RPA实验技巧和问题，以帮助研究人员更好地掌握RPA反应。随后，通过整理数据(如RPA文献中的敏感性和特异性)阐明RPA的临床/现场表现。我们还描述了一些独特的RPA检测方法，为那些谁想要检测RPA分析信号使用的方法，而不是常用的PCR检测方法。为了解该技术在超越PCR和突破实验室界限方面的重要意义，我们讨论了RPA的发展热点，包括定量RPA、多重RPA反应、移动RPA诊断、微流体集成RPA检测和一步法RPA检测。最后，对RPA的未来发展进行了展望。

重组酶聚合酶扩增(RPA)反应

RPA作为取代PCR的革命性方法的突出之处在于其特定的反应组分(表1)和机理。对于一个成功的RPA分析，细微差别取决于内在因素，引物，探针和核酸模板的设计;并且与外部因素有关，如反应温度和搅拌，对错配的耐受性，抑制剂和背景DNA。此外，RPA过程中的核酸标记、RPA扩增子清理和扩增后处理也是成功检测RPA的重要细节。本节提供了从RPA文献中总结的这些实用信息，作为RPA试验设计的指导。此外，读者还可以获得有关市售RPA反应试剂盒和附件的信息(表2和3)。最后，本节通过对RPA文献的数据挖掘来阐明RPA的临床/现场表现，这些文献也被简洁地整理(表4和5)。

2.1 反应成分

RPA的基本反应机制依赖于对称为同源重组的自然细胞过程的综合工程适应，这是DNA代谢的关键过程。标准的RPA反应试剂包括三个关键蛋白(重组酶、重组酶装载因子和单链结合蛋白)，随后与辅助成分如脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、拥挤剂、能量/燃料成分(如三磷酸腺苷、ATP)和盐分子协调，执行RPA反应机制(图2)详细的反应组分及其典型浓度和作用

2.2 机制

RPA首先与T4 UvsX蛋白(重组酶)结合，在T4 UvsY(装载因子)的辅助下，与引物结合形成核蛋白丝。由此产生的复合体在双链DNA中寻找同源序列(图2)。一旦同源性被定位，复合体侵入双链DNA，形成d环结构。D-loop的一侧是双链，引物与模板链杂交，引发链交换反应，而D-loop的另一侧保持单链，即由SSB蛋白(T4 gp32)稳定结合未缠绕的互补链。随后，重组酶从核蛋白丝上分解，并立即可用以启动另一个新的引物链置换反应。

引物结合允许DNA聚合酶(Bsu或Sau)从引物末端的游离3 ' -OH开始合成。随着聚合的继续，两条亲本链继续分离。正向和反向引物的结合使链合成在两个方向上同时发生，并最终导致扩增的双链DNA呈指数级积累，由正向和反向引物之间的序列组成。

在RPA过程中，重组酶-引物复合物的形成是d环形成的速率限制。据报道，当T4 UvsX蛋白完全包裹引物而不与双链DNA结合时，d环的形成是最有效的。SSB蛋白和T4 UvsY(连同ATP)已被证明是与T4 UvsX一起合作进行链交换反应所必需的蛋白质。然而，这两种蛋白质的存在需要更高浓度的T4 UvsX蛋白，而只需要其中一种蛋白质的存在。SSB蛋白可以刺激T4 UvsX降解时的链交换反应。重要的是，T4 UvsY蛋白中和了SSB蛋白和T4 UvsX之间对引物结合位点的竞争，阻止了SSB结合引物引发重组事件。当引物浓度较低时，SSB蛋白抑制T4 UvsX蛋白的链交换活性。然而，一旦提供T4 UvsY蛋白，T4 UvsY蛋白就能够侵入覆盖SSB蛋白的引物，促进T4 UvsX蛋白与引物的结合(从与结合的T4 UvsY蛋白相邻的位点)，从而取代引物上的SSB蛋白。

2.3Template,primers, probe and their designs 模板，引物，探针设计

RPA最初被证明是DNA的核酸扩增方法6，后来发现在同一反应管中加入逆转录酶(如小鼠白血病病毒(MuLV)逆转录酶)也可以作为RNA的模板36，无论何种核酸模板类型，为了有效扩增，推荐的RPA扩增子长度应低于500个核苷酸。大多数已发表的RPA论文的扩增子长度在100到250个核苷酸之间，这通常会产生快速有效的扩增。然而，也报道了较短的扩增子(79个核苷酸;37个，94个核苷酸，38 - 40个)和较长的扩增子(1500个核苷酸6和1941个核苷酸)。

与PCR不同，RPA引物的长度相对较长(建议至少为30个核苷酸，但通常在32至35个核苷酸之间)。较短的PCR引物(通常在18到25个核苷酸之间)也可以用于RPA反应，但可能会降低反应速度和灵敏度。Mayboroda等人、Martorell等人、Wang等人和Fuller等人已经证明了短链PCR引物在RPA中的应用。后两位作者表明，与PCR相比，RPA中使用的PCR引物具有更高的检测灵敏度:RPA分别检测到转基因GTS 40-3-2大豆的100个DNA拷贝和农杆菌的3.5 pg基因组DNA，而基准PCR分别检测到1000个DNA拷贝和350 pg基因组DNA。

销售商业化RPA试剂的公司TwistDx™Ltd(详见第2.4节和表2和3)提供了可在RPA反应期间纳入的附加探针。TwistAmp™exo探针(通常在46至52个核苷酸之间)和TwistAmp®fpg探针(通常在32至35个核苷酸之间)用于荧光实时检测(图3A和B)。这两个探针通常用荧光团、猝灭剂(例如黑洞猝灭剂)标记，该猝灭剂靠近荧光团，以暂时阻止荧光信号，以及阻断剂(例如c3间隔剂、磷酸盐、实时检测是基于荧光探针在荧光团和猝灭剂之间的碱基位点(也称为无嘌呤/无嘧啶位点，位于DNA中(较少出现在RNA中)，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基)上的切割。碱基位点可以是四氢呋喃(THF)或dSpacer (THF的衍生物)或dR基团(基位通过C-O-C连接体的脱氧核糖)。大肠杆菌外切酶III在THF或dSpacer位点切割TwistAmp™外显子探针，而糖基化酶/裂解酶大肠杆菌fpg在dR位点切割TwistAmp™fpg探针(图3A和B)。酶切后，TwistAmp®外显子探针可以作为正向引物。然而，由于糖基化酶/裂解酶大肠杆菌fpg蛋白的不同催化模式(β -消除)，TwistAmp™fpg探针不能作为引物，该引物不能产生可扩展的3 ' -OH基团，而是3 ' -磷酸基团。

第三种探针TwistAmp™LF(通常在46到52个核苷酸之间)用于横向流动条带检测(图3C)。该探针在5 '端被标记(例如用荧光素)，在3 '端有一个阻滞剂，和一个内部基础位点(THF或dSpacer)。Nfo内切酶IV在TwistAmp™LF探针的这个基本位点切割，并产生一个可扩展的3 ' -OH基团用于聚合。然而，与大肠杆菌内切酶III在RPA反应中降解大部分扩增子不同，Nfo内切酶IV产生较慢的信号和不完全裂解以避免扩增子降解(也见2.8节)。因此，TwistAmp™LF探针也可用于选择凝胶电泳(GE)作为检测方法的情况。

为了选择合适的RPA模板，设计引物和探针，用户可以参考TwistAmp™反应试剂盒手册中建议的标准，简而言之：

(1) 建议在模板上选择核苷酸序列成分相对“均衡”的一个区域：

• GC 含量在 40% 到 60% 之间

• 重复序列

• 很少正向/反向重复、回文等

应避开特定基因组内的重复序列，以保持靶标的唯一性。就这一点而言，首选序列的确定方法与 PCR 中的方法大致相同。

(2) 引物GC含量应在30% ~ 70%之间，5′端应避免鸟嘌呤长迹，推荐胞苷类;

• 引物大小最小 30，最大 36

• 引物 GC% 最小 20%，最大 70%

• 引物 Tm 最小 50，最大 100

• 最大允许的单核苷酸重复长度（例如“CCCCC”）设定为 5。

(3)引物3′端推荐添加鸟嘌呤和胞苷，以提高性能。从RPA文献中，进一步建议用户评估这些寡核苷酸之间的熔融温度、杂化稳定性、二级结构和二聚体形成。特定的软件，如BioEdit version 7.0.5.3, Primer3, unfold,mFOLD, Oligoanalyzer 3.1 (IDT, Leuven, Belgium)， PrimerQuest软件(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)和Visual OMP (DNA软件，MI, USA)已在文献中用于分析RPA寡核苷酸特性。一种有效的避免引物二聚体形成的方法是采用自回避分子识别系统(SAMRS)，通过在引物中包含SAMRS核苷酸2-氨基嘌呤-2 '脱氧核糖糖苷(A*)、2 ' -脱氧-2-硫胸苷(T*)、2 ' -脱氧肌苷(G*)和n4 -乙基-2 ' -脱氧胞苷(C*)这些SAMRS核苷酸的包含策略性地将天然A对与T(和G对与C)之间的氢键单元替换为天然T对与SAMRS A*、天然A对与SAMRS T*、天然A对与SAMRS T*、天然C对与SAMRS C*之间的氢键单元。然而，无论SAMRS A*和SAMRS G*核苷酸的浓度如何，它们都不会分别与SAMRS T*和SAMRS C*核苷酸相互作用。在核酸扩增过程中可以避免因引物二聚体而产生的不良产物。52,53这样的SAMRS系统已经被Sharma和他的同事在RPA反应中证明了，并且被证明可以成功地消除RPA假阳性。此外，需要谨慎避免引物和探针之间的重叠，这已显示出阻碍所需的扩增效率。总的来说，遵循所描述的指南作为RPA候选寡核苷酸的计算机优化设计的起点就足够了，然而，最终的候选物应该通过RPA反应进行筛选，以选择适用于特定RPA测定的首选最终寡核苷酸集(例如，TwistDx™Ltd建议设计5个正向和反向引物，以及3个探针)。

2.4 TwistDx™商业化试剂盒及仪器

2.5 Influence of temperature and agitation温度和搅拌的影响

为了使RPA反应达到最佳的效率和分析灵敏度，靶序列的选择以及相应引物和探针的设计是RPA反应的内在决定因素，而反应温度和反应过程中的搅拌是两个最重要的外在影响因素。

推荐的RPA反应温度在37°C - 42°C之间，Crannell等和Wang等人也证明了RPA反应可以通过体温进行，这有利于现场应用。然而，一些研究小组已经研究了RPA反应温度超出推荐范围的情况。测试的最大温度范围为15℃~ 50℃;结果表明，产生阳性结果的边际反应温度应大于30℃。然而，Sun等人和Poulton和Webster研究表明，在低至25℃的温度下，经过RPA扩增和随后的侧流条带检测，仍然可以产生阳性信号。此外，Lillis等研究表明，环境温度对RPA反应也有影响:当环境温度低于10℃时，RPA反应是不稳定的，但延长反应时间可以提高阳性结果的可得性。这种反应温度范围的研究表明，RPA反应不需要精确的温度控制。

虽然反应温度为RPA酶提供了合适的工作环境，但搅拌增加了均相反应溶液中RPA组分之间的相互作用。TwistDx™建议用户执行RPA反应的两次混合步骤，一次在反应开始时，另一次在反应4分钟后。前者是将所有的RPA试剂混合在一起引发反应，后者是防止反应试剂的局部耗竭，从而提高反应收率。Wambua等人报道，当搅拌4分钟后形成时，在5-8分钟内达到阈值荧光值，而在没有搅拌的情况下达到可检测水平的时间为8 - 14分钟。此外，不断震动的RPA反应贯穿始终进一步加快了RPA反应速度，获得了更稳定的阳性结果，提高了灵敏度，特别是当模板浓度接近检测极限时。Kersting等人报道，与推荐的两次震动相比，持续震动会在横向流带上产生更快、更稳定的信号。Kalsi等人也报道了RPA exo分析法中微滴的连续混合可以缩短出结果的时间，增加荧光并提高灵敏度。此外，Moody等人建立了数学模型，结果表明，机械搅拌优于手动搅拌，可以消除操作员之间的变化，获得一致的定量实验结果;然而，理想的混合频率是化验依赖，并应确定在反应之前。然而，如果没有摇晃条件，Lillis等人证明，减少反应体积(例如从50µL到5µL)可以补偿摇晃效应，因为较小的体积增加了扩增所需的试剂和寡核苷酸之间的相互作用。

2.6 Tolerability to mismatches, inhibitors and background DNA DNA错配，抑制剂，背景DNA耐受能力

除了温度和搅拌外，对错配，抑制剂和背景DNA的耐受性是有效和灵敏RPA反应的其他重要因素。RPA具有耐受错配的能力，迄今为止报道的最高的错配受体能力是在引物和探针结合位点上的9个核苷酸碱基对。研究还表明，引物5′端或中心的错配对RPA反应的影响较小，而位于引物3′端的错配对RPA反应的影响较大。这与RPA反应机制一致(见2.2节)，因为聚合酶从3 '端延伸引物和探针(一旦被切割)。这种错配敏感性在3 '端有用的应用是区分单核苷酸多态性多态性(SNP)。Yamanaka等人利用这一特性来区分烟草使用障碍基因的多态性;当引物的3′端碱基与目标匹配时，DNA聚合酶延伸是有效的，当3 '端碱基不匹配时,而DNA聚合酶延伸是低效的或不存在的。

然而，一般的RPA错配耐受性(在引物的3 '端之外)可能是有利的，因为它在引物设计高度多态性靶标时具有一定的灵活性，在这些靶标中，长期保守的靶标区域很难定位。相反，这种错配耐受性的退缩是对密切相关物种的非特异性检测的趋势。事实上，Patel等人87、Moore等人88和Yang等人69在检测基孔肯雅病毒、流行性人诺如病毒和猪圆环病毒2型时，分别观察到非特异性检测。

在测试临床或现场样品时，在样品制备和处理步骤中存在或可能引入许多物质(例如抑制剂)，这些物质可能会干扰核酸扩增。RPA已被证明耐受某些(PCR)抑制剂，包括:(1)血红蛋白(20 g L−1)、肝素(0.5 U)和尿液(1.25%)对RPA反应没有影响；62、91 (2)血红蛋白(50 g L−1)、乙醇(4% v/v)和尿液(高达5%)，它们仅轻微影响反应。62,91,92 然而，在SDS (0.05% v/v)和尿液(10%)的存在下，RPA反应被完全抑制。62,91 还观察到，当DNA模板浓度接近检测极限时，RPA反应更容易受到抑制剂的影响。然而，仔细考虑样品制备和处理步骤的萃取缓冲液或培养介质的选择也很重要，因为这些工作溶液也可能含有潜在的抑制剂。例如，Valasevich和Schneider72发现十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) DNA提取缓冲液强烈抑制RPA反应。同样，Liu et al.93发现亚硒酸盐胱氨酸肉汤(细菌富集培养基)显著影响RPA反应，导致大量引物二聚体，导致侧流条带检测结果假阳性。

除了耐受抑制剂外，RPA还能够在背景DNA存在的情况下扩增靶核酸。94 - 97然而，与对抑制剂的耐受性类似，对背景DNA的耐受性也依赖于浓度。Clancy等人97观察到，当存在400 ng背景人DNA时，RPA反应被显著抑制，但当存在200 ng背景人DNA时，RPA反应的抑制程度要小得多。Rohrman和RichardsKortum94表明，当存在50份人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)靶DNA时，0.5µg剪切鲑鱼精子DNA可以完全抑制RPA，而当存在103份或106份靶DNA时，剪切鲑鱼精子DNA仅能抑制2或5µg RPA。此外，Rohrman和Richards-Kortum94还指出，试验中使用的引物、探针和靶序列会影响最大背景DNA浓度耐受性。当103份HIV-1和恶性疟原虫的靶DNA存在时，2µg剪切鲑鱼精子DNA分别完全抑制了HIV-1和恶性疟原虫的RPA检测，然而当存在相同数量的目标DNA(103份)时，溶组织内阿米巴和十二指肠贾第鞭毛虫分别仅被1µg和0.5µg剪切的鲑鱼精子DNA完全抑制94。

2.7 Nucleic acid labelling during RPA RPA过程中的核酸标记

多种下游RPA应用(例如侧流条带检测和酶联免疫吸附测定)的一个重要过程是在RPA反应期间将标签纳入核酸模板中，以便纳入的标签允许捕获，检测和/或协助RPA分析的信号生成。这种核酸标记可以末端使用5 '标记的引物或内部通过标记的核苷酸来实现。39,40,98 - 104用于核酸标记的标签可以是荧光实体(例如荧光素)、配体(例如生物素)或甚至是核苷酸的短片段(悬垂)。大多数使用RPA的末端核酸标记都使用5 '标记的正向和反向引物，这样扩增子具有双重标记，可以在下游检测中被相应的识别分子捕获和检测。然而，RPA仅通过5 '标记过程耐受某些标签。Crannell et al.105报道了5种不同的5 ' -标记(Cy5、Cy3、溴脱氧尿嘧啶、四氯荧光素和六氯荧光素)与3种5 ' -标记(Alexa Fluor488、荧光素和地高辛)成功结合的RPA失败案例。

对于RPA过程中的内部核酸标记，反应混合物可以补充标记的核苷酸，主要是使用地高辛- dutps，在聚合酶延伸过程中随机替代dTTPs来产生标记的扩增子。101-104与末端标记相比，内部标记允许将更多的标记并入单个核酸模板，从而在下游分析中具有更多的结合机会。然而，当下游应用于三明治分析时，末端标记可能是一个更好的选择，因为通过末端标记结合的两个标签相距更远(由扩增子的长度分开)，如果标签靠得太近，这可以防止结合的空间位阻。

2.8,Amplicon,clean-up,and,post-amplification treatment扩增子的纯化和扩增后处理

上述问题考虑了RPA反应前和反应时的条件。此外，反应后处理流程对于成功检测RPA信号至关重要，应根据RPA扩增子的预期用途来确定。RPA扩增子的产生依赖于RPA反应试剂盒。使用TwistAmp®Basic试剂盒(也称为Basic RT试剂盒)从正向和反向引物中产生单个扩增子。相反，使用TwistAmp®exo试剂盒(也包括exo RT试剂盒)和TwistAmp®fpg试剂盒不会产生单个扩增子，前者是由于反应混合物中存在的外切酶在RPA反应中消化了大部分扩增子42，后者是由于糖基化酶/裂解酶大肠杆菌fpg裂解产生不可扩展的3 ' -磷酸基(参见第2.3节)46，然而，对于TwistAmp®nfo试剂盒，由于DNA聚合酶对探针引物模板的置换活性，产生了两种类型的扩增子:双标记扩增子作为探针和其中一种引物的短产物出现，而单标记扩增子作为正引物和反向引物的长产物出现(图3C)(注意，在基于夹心法的横向流条检测的测试区域中，只有双标记产物会产生阳性信号)105 - 108。

然而，RPA扩增子最初与蛋白质和拥挤剂相关，由此产生的DNA -蛋白质-拥挤剂复合物阻止了直接使用DNA分子进行凝胶电泳检测。109,110这是因为这些复合物影响了凝胶电泳中扩增子的正确迁移，导致凝胶上的团块涂片。在凝胶电泳检测之前，文献中已经报道了几种方法来处理RPA扩增子，这些方法包括通过加热(65°C或95°C 10分钟)和洗涤剂处理(例如十二烷基硫酸钠，SDS)使蛋白质变性，酶切(例如proteinase K)，通过高速离心使蛋白质沉淀，并使用商业DNA清理试剂盒进行纯化。其中加热法与蛋白酶K消化法或SDS处理法的效果相当。109,111然而，在65℃下加热10分钟比在更高温度下(95℃)加热效果更好。SDS处理(在上样缓冲液中占20%)产生的凝胶带比蛋白酶K消化法(0.2 mg mL - 1或20 mg mL - 1)产生的凝胶带更亮、更厚109;而在Londono和同事的研究结果中，65°C 加热10分钟产生的凝胶带的亮度与SDS处理方法(在上样缓冲液中占5%或10%)产生的凝胶带相当。Kapoor及其同事表明，SDS处理方法(在加载缓冲液中占5%)比加热方法(65°C 10分钟)产生更亮的凝胶带，但也导致靶带上方出现涂片样图案。111,112与加热、蛋白酶K消化和SDS处理方法相比，使用商业化DNA清理试剂盒只产生目标条带，但条带强度低得多。此外，作为一种替代方法，离心(3分钟)对颗粒RPA蛋白的性能与加热方法(65°C,10分钟)相当。

与横向流动条带检测一样，可以直接使用RPA扩增子，但建议在运行条带之前用运行缓冲液(例如1/100稀释)稀释扩增子，以(1)提高其吸湿性能114和(2)避免“鬼带”效应。45,54,115 - 117值得注意的是，Powell及其同事指出，通过替换高分子量PEG (5.5% 35 kDa;114 .另见2.1节)，在RPA试剂配方中使用低分子量PEG (6.5% 3 kDa)。此外，Powell及其同事还开发了一种方法，以减轻横向流动条带检测的稀释步骤。他们发现，有时RPA扩增子在“RPA微球”中不可用（核酸扩增的核心包含局部的RPA试剂图5A）。其形成与PEG高度相关，用于结合到侧流条测试线上。然而，使用双标记探针(两个标签通过短长度连接物连接)可以在酶切后从“RPA球”中逃逸，允许扩增子准备好进行下游三明治检测(图5B)114。

2.9 Sensitivities and specificities灵敏性和特异性

RPA的灵敏性和特异性可分为两类，即分析性和临床(或现场)。分析灵敏度表示测定法可以检测到的最低分析物量(也称为检测限);分析特异性是一种分析方法测量样品中一种特定分析物而不是其他分析物的能力。118 临床敏感性是临床阳性样本的正确检出百分比，而临床特异性是临床阴性样本的正确检出百分比。

从分析灵敏度和特异性的角度来看，RPA非常敏感，可以检测到少量被分析物的分子(拷贝)，接近PCR的分析灵敏度(表5)。此外，RPA也可以实现超灵敏的检测，甚至可以检测到单个被分析物的拷贝(表4)。在大多数情况下，RPA对于将一个物种与其他非密切相关的物种区分开来是非常特异性的。这些酶进行同源性定向修复的天然功能成为RPA区分近缘物种的缺点，特别是当这些物种具有高序列相似性时。69,87,88相反，这表明RPA可以在一定程度上容忍引物或探针与目标序列的不匹配(详见2.6节)。

除了测量分析灵敏度和分析特异性外，许多研究者还将RPA应用于临床或现场样品的检测，并将结果与标准方法(多为PCR)进行比较。从总结表5可以看出，RPA的临床敏感性仅为基准法的一半，而RPA的临床特异性大部分时间与基准法相当。这些结果表明，RPA可能(仅在某些情况下)误检阳性样本(假阴性)，但不太可能显示假阳性。总之，RPA仍处于临床/现场试验评价的初期，尚未成熟到可以作为临床/现场常规试验。