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用于呼吸道病原体快速检测的微流控系统

由细菌、病毒、真菌甚至寄生虫引起的呼吸道感染(RTIs)严重威胁全球公共卫生,是传染病和高死亡率的主要原因。据统计,全球每年约有400万人死于呼吸道感染(占全部死亡人数的7%),其中儿童占12%~19%。细菌引起的呼吸道感染是重症和死亡病例的主要原因。然而,由细菌引起的RTIs的临床症状与病毒引起的呼吸系统疾病相似,在病原未明确的情况下难以进行针对性的药物治疗。此外,在呼吸道感染高发时期,由于其强传播性和季节性特征,医疗机构将面临较大的病原检测负担。因此,迫切需要开发快速、准确、易于操作的RTIs病原体高通量诊断筛查方法,这对确保适当的药物治疗和感染控制措施的有效实施具有重要意义。

目前,基于核酸识别的分子诊断方法在周转周期、特异性、敏感性以及对难以培养病原体的鉴定方面具有明显优势,是广泛应用于临床样本中呼吸道感染(RTIs)诊断的理想选择。其中由CRISPR介导的诊断技术是一种前景广阔的靶向基因检测技术,极大提升了检测的灵敏度、特异性和稳健性。然而,大多数CRISPR介导的诊断仍然依赖于初始扩增阶段,这导致可能会出现复杂反应步骤和假阳性信号,导致额外的时间和试剂损耗。为了在病原体诊断中获得更广泛和更实际的应用,这些CRISPR介导的诊断系统仍需要进一步开发或改进。

微流控芯片系统由一组通过微流控网络连接的功能单元组成,为临床分子诊断提供了一种小型化的选择。然而,在以往的工作中可以发现,获取目标病原体的DNA仍需要长时间的样本预处理和芯片外部操作,这增加了操作步骤的复杂性和结果的偏差。将DNA提取模块集成在微流控芯片上,不仅有助于创建可输入携带样本的平台,还提供了细菌与DNA之间的标准化转换过程,因此如何满足分子微生物诊断中灵敏的多重分析需求,还需要进一步研究。

近期,来自福建医科大学、暨南大学等机构的研究人员共同开发出一种与RAA-CRISPR系统集成化的离心式微流控芯片,并基于此构建了多路微流控芯片(AMIC)系统以实现对呼吸道病原体的快速检测。相关成果以“Automatic Microfluidic Harmonized RAA-CRISPR Diagnostic System for Rapid and Accurate Identification of Bacterial Respiratory Tract Infections”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上。

在这项研究中,研究人员报道了一种协调的RAA-CRISPR检测的设计原理。协调的RAA-CRISPR检测的工作机制分为3个动态模块:基于RAA的目标基因组DNA的识别和扩增、扩增DNA序列的转录和Cas13a酶的启动。其中RAA的工作温度与CRISPR相同(37~42℃),为一锅法提供了基础依据。

研究证实,基因组DNA的同源序列被引物与重组酶结合形成的蛋白质-DNA复合体识别并实现指数扩增。T7RNA聚合酶介导的转录过程需要上游引物与启动子序列的识别,可有效避免转录过程中基因组DNA的降解。通过调控扩增和转录效率,可稳定增加目标DNA和相应RNA的数量,为后续CRISPR反应提供启动子。与通常用于DNA检测使用的Cas12a酶不同,Cas13a酶是特异性靶向RNA序列的2类vi型效应蛋白,并且对靶RNA和非特异性ssRNA具有切割活性。这一特性确保了CRISPR不会影响基于DNA序列的RAA反应进程。此外,活化的Cas13a酶在切割被设计为荧光探针的ssRNA可触发荧光的释放。因此与两步CRISPR技术相比,统一的RAA-CRISPR技术实现了一锅法检测,不仅便于反应整合,而且提高其反应效率。因此,本文提出的基于RAA-CRISPR协调策略的AMIC系统提供了一种简单、高灵敏度、高特异性的荧光DNA检测方法。

 

              AMIC系统的工作流程和协调化RAA-CRISPR检测的设计示意图

本研究在常规检测条件下,设置RAA和cas13a酶的不同浓度组成以此实现窗口对接。结果表明,设置RAA浓度在0.6~1.2x之间可以达到良好的早期扩增目的,并为后续的CRISPR系统反应提供足够数量的启动子,考虑到级联效应和活性保留问题,研究得出0.9x RAA和120 nM Cas13a酶的浓度适合构建协调化RAA-CRISPR检测的结论。同时,在不限制扩增过程的情况下,转录效率的增加有利于Cas13a酶的激活。为了探索扩增和转录之间的临界值,实验使用了四种不同浓度的DNA来检测转录对扩增率的影响。当转录酶活性在4~5U之间时,RAA的反应速率处于峰值阶段。因此,4U被选择为最合适的转录活性,并可为后续的CRISPR系统提供靶向RNA。此外,系统中过量靶标的存在会与crRNA竞争Cas13a酶的结合位点,从而降低检测信号,导致检测结果的不准确。实验比较了不同市售缓冲液对合成 DNA或RNA模板的RAA和CRISPR介导的检测的影响,研究表明CutSmart缓冲液显示出重组酶与Cas13a酶之间更好的协调性。

实验以鲍曼不动杆菌为例设计并筛选了两种具有高活性的crRNA,并将其定向到同一靶向RNA的不同区域,并对单个crRNA和组合crRNA的催化性能进行了测试。结果表明,组合crRNA在固定靶DNA浓度(1 ng)下检测时,与单个crRNA反应的灵敏度值相比可显著增加至1.6倍。这一结果表明组合crRNA在RAA-CRISPR系统中具有反应优势,同时这一策略被继续用于构建其他11种呼吸细菌的实验。在CRISPR介导的检测中,Cas13a酶和crRNA 的化学计量学是一个关键因素。结果显示在体反应中,含有7尿嘧啶(U)的FQ报告剂的反应速度明显快于其他不同碱基组成的FQ报告剂(poly-A、poly-U、poly-C和poly-G)或不同长度(5~15个核苷酸)的反应,在进一步监测FQ报告量对检测信号的影响时发现,在500 nM检测范围内,荧光强度与报告蛋白数量呈正相关关系。结果表明,统一的RAA-CRISPR的建立相比以往的RAA-CRISPR反应系统,可以更快速有效地启动CRISPR/Cas系统的切割活性并进一步节省了检测时间,相关结果特性可体现在12种呼吸道细菌的检测时间中。