由细菌、病毒、真菌甚至寄生虫引起的呼吸道感染（RTIs）严重威胁全球公共卫生，是传染病和高死亡率的主要原因。据统计，全球每年约有400万人死于呼吸道感染（占全部死亡人数的7%），其中儿童占12%~19%。细菌引起的呼吸道感染是重症和死亡病例的主要原因。然而，由细菌引起的RTIs的临床症状与病毒引起的呼吸系统疾病相似，在病原未明确的情况下难以进行针对性的药物治疗。此外，在呼吸道感染高发时期，由于其强传播性和季节性特征，医疗机构将面临较大的病原检测负担。因此，迫切需要开发快速、准确、易于操作的RTIs病原体高通量诊断筛查方法，这对确保适当的药物治疗和感染控制措施的有效实施具有重要意义。
目前，基于核酸识别的分子诊断方法在周转周期、特异性、敏感性以及对难以培养病原体的鉴定方面具有明显优势，是广泛应用于临床样本中呼吸道感染（RTIs）诊断的理想选择。其中由CRISPR介导的诊断技术是一种前景广阔的靶向基因检测技术，极大提升了检测的灵敏度、特异性和稳健性。然而，大多数CRISPR介导的诊断仍然依赖于初始扩增阶段，这导致可能会出现复杂反应步骤和假阳性信号，导致额外的时间和试剂损耗。为了在病原体诊断中获得更广泛和更实际的应用，这些CRISPR介导的诊断系统仍需要进一步开发或改进。
微流控芯片系统由一组通过微流控网络连接的功能单元组成，为临床分子诊断提供了一种小型化的选择。然而，在以往的工作中可以发现，获取目标病原体的DNA仍需要长时间的样本预处理和芯片外部操作，这增加了操作步骤的复杂性和结果的偏差。将DNA提取模块集成在微流控芯片上，不仅有助于创建可输入携带样本的平台，还提供了细菌与DNA之间的标准化转换过程，因此如何满足分子微生物诊断中灵敏的多重分析需求，还需要进一步研究。
近期，来自福建医科大学、暨南大学等机构的研究人员共同开发出一种与RAA-CRISPR系统集成化的离心式微流控芯片，并基于此构建了多路微流控芯片（AMIC）系统以实现对呼吸道病原体的快速检测。相关成果以“Automatic Microfluidic Harmonized RAA-CRISPR Diagnostic System for Rapid and Accurate Identification of Bacterial Respiratory Tract Infections”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上。
在这项研究中，研究人员报道了一种协调的RAA-CRISPR检测的设计原理。协调的RAA-CRISPR检测的工作机制分为3个动态模块：基于RAA的目标基因组DNA的识别和扩增、扩增DNA序列的转录和Cas13a酶的启动。其中RAA的工作温度与CRISPR相同（37~42℃），为一锅法提供了基础依据。
研究证实，基因组DNA的同源序列被引物与重组酶结合形成的蛋白质-DNA复合体识别并实现指数扩增。T7RNA聚合酶介导的转录过程需要上游引物与启动子序列的识别，可有效避免转录过程中基因组DNA的降解。通过调控扩增和转录效率，可稳定增加目标DNA和相应RNA的数量，为后续CRISPR反应提供启动子。与通常用于DNA检测使用的Cas12a酶不同，Cas13a酶是特异性靶向RNA序列的2类vi型效应蛋白，并且对靶RNA和非特异性ssRNA具有切割活性。这一特性确保了CRISPR不会影响基于DNA序列的RAA反应进程。此外，活化的Cas13a酶在切割被设计为荧光探针的ssRNA可触发荧光的释放。因此与两步CRISPR技术相比，统一的RAA-CRISPR技术实现了一锅法检测，不仅便于反应整合，而且提高其反应效率。因此，本文提出的基于RAA-CRISPR协调策略的AMIC系统提供了一种简单、高灵敏度、高特异性的荧光DNA检测方法。
AMIC系统的工作流程和协调化RAA-CRISPR检测的设计示意图
本研究在常规检测条件下，设置RAA和cas13a酶的不同浓度组成以此实现窗口对接。结果表明，设置RAA浓度在0.6~1.2x之间可以达到良好的早期扩增目的，并为后续的CRISPR系统反应提供足够数量的启动子，考虑到级联效应和活性保留问题，研究得出0.9x RAA和120 nM Cas13a酶的浓度适合构建协调化RAA-CRISPR检测的结论。同时，在不限制扩增过程的情况下，转录效率的增加有利于Cas13a酶的激活。为了探索扩增和转录之间的临界值，实验使用了四种不同浓度的DNA来检测转录对扩增率的影响。当转录酶活性在4~5U之间时，RAA的反应速率处于峰值阶段。因此，4U被选择为最合适的转录活性，并可为后续的CRISPR系统提供靶向RNA。此外，系统中过量靶标的存在会与crRNA竞争Cas13a酶的结合位点，从而降低检测信号，导致检测结果的不准确。实验比较了不同市售缓冲液对合成 DNA或RNA模板的RAA和CRISPR介导的检测的影响，研究表明CutSmart缓冲液显示出重组酶与Cas13a酶之间更好的协调性。
实验以鲍曼不动杆菌为例设计并筛选了两种具有高活性的crRNA，并将其定向到同一靶向RNA的不同区域，并对单个crRNA和组合crRNA的催化性能进行了测试。结果表明，组合crRNA在固定靶DNA浓度（1 ng）下检测时，与单个crRNA反应的灵敏度值相比可显著增加至1.6倍。这一结果表明组合crRNA在RAA-CRISPR系统中具有反应优势，同时这一策略被继续用于构建其他11种呼吸细菌的实验。在CRISPR介导的检测中，Cas13a酶和crRNA 的化学计量学是一个关键因素。结果显示在体反应中，含有7尿嘧啶（U）的FQ报告剂的反应速度明显快于其他不同碱基组成的FQ报告剂（poly-A、poly-U、poly-C和poly-G）或不同长度（5~15个核苷酸）的反应，在进一步监测FQ报告量对检测信号的影响时发现，在500 nM检测范围内，荧光强度与报告蛋白数量呈正相关关系。结果表明，统一的RAA-CRISPR的建立相比以往的RAA-CRISPR反应系统，可以更快速有效地启动CRISPR/Cas系统的切割活性并进一步节省了检测时间，相关结果特性可体现在12种呼吸道细菌的检测时间中。
协调RAA-CRISPR检测方法的构建与优化示意图
为了减少底物对随后的协调RAA-CRISPR检测的影响，实验将Chelex-100集成到芯片中进行核酸纯化。Chelex-100具有显著的金属离子特异性选择性和强大的结合强度，可促进核酸抑制剂在不同样品基质上的有效吸附。将Chelex-100集成到离心微流控芯片上，提供了一种快速直接的核酸纯化方法，从而避免了有机溶剂的使用并简化了与核酸扩增相关程序的复杂性。同时为保证热裂解过程不影响芯片结构或气密性，对目标呼吸道病原体在95°C下裂解8 min的芯片性能进行了研究，确定此条件为最佳反应时间和温度。对于简单的热裂解，细胞裂解过程中释放的蛋白质和盐没有被去除，这抑制了下游协调化RAA-CRISPR检测的效率。相比之下，Chelex-100微球的纯化有效地去除了反应中的蛋白和盐，增强了后续CRISPR介导系统的信号。在多个目标浓度下，检测灵敏度和反应动力学均显著提高。
实验采用磁珠法、吸附柱法、芯片外Chelex-100和芯片内Chelex-100提取DNA，以此来比较相同细菌浓度下四种不同方法的核酸提取效率。选取革兰氏阳性菌（缩写为GPB，以肺炎克雷伯菌为代表）和革兰氏阴性菌（缩写为GNB，以金黄色葡萄球菌为代表）进行检测。结果表明，基于芯片内Chelex-100的AMIC系统具有与磁珠法相当的优异DNA提取效率，尤其在GPB的提取效率上具有显著优势。同时AMIC系统在GPB和GNB之间表现出较好的兼容性，芯片集成化操作并未降低Chelex-100的纯化效果。此外，芯片集成有效地提高了DNA的利用率（25 μL），这是由于所有提取的DNA都用于AMIC系统中随后的协调RAA-CRISPR检测，然而芯片外方法仅可利用25 μL中的1 μL。因此AMIC系统的程序集成化大大缩短了诊断的操作周期至40 min即可完成。结果表明，该核酸提取模块与AMIC系统中的协调RAA-CRISPR反应兼容。
集成芯片上的核酸提取
芯片内部冻干检测试剂的存储特性对于实现AMIC系统的无限制部署至关重要。通过对不同试剂组分的冻干顺序、保护剂的用量、RNase抑制剂的浓度和冻干程序进行优化，获得了理想的即用型AMIC体系。用原始的AMIC缓冲液冻干会导致冻干后活性显著下降。通过逐步验证，crRNA和MgAc试剂的使用被确认为关键参数，因此本实验多步冻干步骤和添加保护剂的策略有效地保持了AMIC系统的检测性能。此外，MgAc被储存在微通道中，在程序执行期间DNA溶液将跟随微通道进入反应室，尽管在较低的目标DNA浓度下最大荧光强度降低，但AMIC系统在冻干后仍能保持其检测灵敏度。
对于长期储存，核糖核酸酶可以通过降解CRISPR中的crRNA削弱总体检测性能并使用核糖核酸酶抑制剂来预防和控制污染。由于一个报告分子能在核糖核酸酶活性存在时发出荧光，RNaseAlert证实了环境和样品中存在高水平的核糖核酸酶。经研究表明，6 μM的核糖核酸酶抑制剂被认为是最合适的浓度。此外，冷冻干燥对加快酶活性恢复速度和提高贮藏稳定性具有重要作用。液氮冷冻干燥获得的微球形态与直接冷冻干燥获得的干粉形态相比具有更好的储存性能：微球形态（延迟3分钟）比干粉形态（延迟5分钟）更有利于动力学恢复，室温下的稳定性长达1周，这为在没有低温运输条件情况下AMIC系统仍能快速部署提供良好的先决条件。
AMIC系统的易用性和可部署性优化
为了确定目标丰度与AMIC系统检测性能之间的关系，以不同浓度（10~10⁷ CFU/mL）的12种呼吸道细菌的人痰标本为底物检测相应的信号强度。结果表明，在目标DNA浓度低至10 CFU/mL时，AMIC系统仍能够快速诊断病原体，相关系数（R）分布范围为0.849~0.997。为了评估特异性，研究人员使用12株模型菌株和6株人类呼吸道病原体来评估AMIC系统的特异性。结果显示，在相应的检测单元中，只有目标菌呈阳性，其他非目标呼吸道病原体和空白对照均呈阴性。
鲍曼不动杆菌作为临床样本中出现概率最高的菌种被用于测试AMIC系统对不同浓度病原体（高、中、低浓度）的可重复性。进一步研究发现该系统在多靶点检测中可以考虑不同浓度水平，其高检测精度保证了获取与病原体种类和丰度相关的信息，从而可以准确评估呼吸道感染的严重程度和用药策略。
同时本研究采用呼吸道细菌培养方法和qPCR方案作为参考测试，验证了AMIC系统的临床性能。对来自呼吸道感染患者的48份人类痰样本和来自健康人群的12份阴性样本进行了并排检测，结果显示AMIC系统在48份培养方法阳性样本中的48份（100%灵敏度）和培养方法阴性样本（100%特异性）中检测到68个靶向DNA。研究表明AMIC系统比qPCR检测更灵敏，大大缩短了样品到反应的时间和步骤。且AMIC系统擅长于检测含有多种病原体（2~6种）的样品，从而实现识别可能被传统培养方法遗漏的潜在传染性个体。值得注意的是，该样本组中多种病原体感染的负荷分布比一般人群的预期低20~100倍（中位负荷为~3.2 x 10² CFU/mL），这更加突显了AMIC系统的临床诊断性能。该研究分析方法正确地识别了所有阳性样品，这证实了AMIC系统的临床性能与其分析性能相当。
在进一步研究中，本实验将AMIC系统的临床性能与两种广泛使用的鉴定方法Bl和MALDITOFMS（MTM）进行比较。尽管基于培养的Bl和MTM显示出完美的灵敏度（~4.2x10 CFU/mL），但它们不能同时识别多种病原体且样品到反应的时间较长。相比之下，在患者样品上建立的AMIC系统结合了高灵敏度和高通量检测并展示了它的用户友好性。
AMIC系统检测12种呼吸道细菌的分析性能
综上所述，本研究构建了具有高转换效率的RAA-CRISPR协调检测策略，并将其集成到多路微流控芯片（AMIC系统）中且成功应用于12种呼吸道细菌的同时检测。通过调节化学反应的关键参数，建立了等温目标扩增与CRISPR系统之间的窗口匹配，进一步增强了基于CRISPR的诊断的检测能力，使其成为一种单一的检测方法，而不受底物抑制的限制。将核酸提取和纯化集成在AMIC系统的芯片上，使样品处理在10 min内完成，提高了核酸的利用率和整体检测的自动化程度。采用冻干程序简化分析工作流程，便于其运输和储存，同时不削弱敏感性。冻干试剂的AMIC系统对12种呼吸道细菌具有良好的特异性，可准确定量范围为10~10⁷ CFU/mL。通过高通量、核酸提取和多重检测相结合，AMIC系统可扩展性强，适用于临床实验室呼吸道病原体的检测。该AMIC系统有望作为其他类型传染病的有效工具，并可用于其他样本类型，实现更全面的诊断和监测能力。