水稻干尖线虫又称贝西滑刃线虫 (Aphelenchoides besseyi)，是水稻白尖病的致病因子，该线虫通过种子进行传播，寄生于种子中在干燥的条件下可存活3年。其所引起的水稻干尖线虫病广泛发生在世界各国水稻产区，严重感染可造成50%的产量损失。同时，水稻干尖线虫寄主范围广泛，除水稻外还可以寄生35个属200多种植物，且该线虫还可以取食多种真菌，被列为全球危害最为严重的十大植物寄生线虫之一。因此，快速、高特异性、准确地检测水稻种子中的水稻干尖线虫是监测、预防和控制水稻白尖病的重要手段。针对于此，上海市农科院作物育种栽培研究所农业遗传育种重点实验室曹黎明团队等[1]开发了一种新颖的RPA-Cas12a-Ab方法来检测水稻干尖线虫，研究中所使用的Cas12/13试纸条购自南京沃博生物科技有限公司，Cas12a购自吐露港生物科技有限公司。
01：建立RPA-Cas12a-Ab检测体系
该方法的技术路线是将CRISPR/Cas12a与RPA技术相结合，具体来说，首先37℃下进行20分钟水稻干尖线虫核酸的RPA扩增，随后扩增产物进行20分钟 CRISPR/Cas12a反应即可通过荧光分析仪读取结果。为了方便现场检测，可采用侧流层析试纸条进行读取，耗时约5分钟（图1）。使用荧光分析仪时，该体系的LOD可达到1 copy/μL含目标片段的质粒；结合侧流层析试纸条检测，该体系的LOD可达到1000 copies/μL含目标片段的质粒。
图1.RPA-Cas12a-Ab检测示意图
对于水稻干尖线虫的核酸提取，作者采用的是改进的贝尔曼漏斗法。而后对提取的核酸进行RPA扩增。为达到检测性能最佳，首先对RPA引物进行评估，在25°C、28°C、32°C、35°C、37°C、39°C、42°C和45°C不同温度下对含有线虫目标片段的重组质粒进行扩增，所有温度下均能扩增，但为了方便实验操作和对降低设备的要求，后续RPA反应选择37°C，该温度也有利于Cas12a活性的发挥（图2）。
图2.不同温度下的RPA扩增
紧接着，作者选用ToloBio提供的的LbCas12a（#32108-03，Tolo Biotech, Anhui, China），利用该酶的反式切割活性建立了CRISPR检测体系。crRNA是影响Cas12a反式切割活性的主要因素，所以作者针对水稻干尖线虫目标片段设计了8条crRNA进行crRNA的筛选，最终选择高活性的crRNA5用于后续检测，该crRNA5可在20分钟时间内获得理想的结果（图3）。
图3.不同crRNA的筛选
02：RPA-Cas12a-Ab检测体系的性能测试
初步建立 RPA-Cas12a-Ab检测体系后，研究者们测试了该体系的特异性。结果表明，RPA-Cas12a-Ab检测体系对2例水稻干尖线虫样本（AB1、AB2）和含水稻干尖线虫目标片段的质粒检测呈阳性；而对3例非水稻干尖线虫样本（AF、AS、MI），以及水稻叶片基因组样本（Rice Leaf）均无扩增，也无CRISPR检切信号，结果为阴性。证明了RPA-Cas12a-Ab检测方法的特异性（图4）。
图4. RPA-Cas12a-Ab特异性验证
作者使用含有水稻干尖线虫目标片段的重组质粒pUC57-18S对RPA-Cas12a-Ab检测体系的灵敏度进行了测试，同步对比PCR与qPCR检测方法。PCR和qPCR的LOD分别为为103和101 copies/μL，而RPA-Cas12a-Ab测定的LOD达到了1 copy/μL，证明了RPA-Cas12a-Ab测定在水稻干尖线虫检测中比PCR和qPCR方法更灵敏。使用提取的水稻干尖线虫的基因组DNA进行10倍梯度稀释后，RPA-Cas12a-Ab可成功检出10-7稀释的基因组DNA样本（图5）。
图5. RPA-Cas12a-Ab灵敏度测试
03：RPA-Cas12a-Ab结合试纸条用于现场快速检测
为便于现场检测及方便用户，作者将RPA-Cas12a与LFA技术相结合，建立了RPA-Cas12a-Ab-LFA检测方案。同样地，作者对此简易化检测系统进行了特异性和灵敏度的验证。水稻干尖线虫样品（AB1和AB2）显示出与阳性对照相似的清晰条带，非水稻干尖线虫样品（AF，AS和MI）未观察到交叉反应，这也证明了RPA-Cas12a-Ab-LFA检测体系的特异性。使用含有水稻干尖线虫目标片段的重组质粒pUC57-18S和提取的水稻干尖线虫的基因组DNA进行10倍梯度稀液后测试灵敏度，结果表明，该系统可检测到1000 copies/μL的含目标片段质粒样本，或是10-1稀释的水稻干尖线虫基因组DNA提取样本（图6）。
图6.RPA-Cas12a-Ab-LFA特异性、灵敏度验证总结
总结：
总的来说，作者开发了一种新颖的RPA-Cas12a-Ab（-LFA）检测方法，不依赖于复杂的设备和熟练的操作人员，RPA扩增和CRISPR/Cas12a反应均可在37℃下完成，仅需一台荧光分析仪或试纸条即可完成快速检测，可在45分钟内获得高灵敏、高特异性的检测结果。此开发思路可广泛应用于其它作物感染疾病或不同病原体的检测。
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Cas酶系列：
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品牌 |
货号 |
包装规格 |
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ToloBio |
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恒温扩增试剂盒及试纸条系列：
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货号 |
产品 |
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Tiosbio® CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条 |
50T |
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50T |
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JY0308 |
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50T |
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RNA恒温快速扩增试剂盒（液体荧光型） |
100T
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参考文献：
[1].Zhang A, Sun B, Zhang J, et al. CRISPR/Cas12a Coupled With Recombinase Polymerase Amplification for Sensitive and Specific Detection of Aphelenchoides besseyi[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 912959.