载体是携带目的基因进入宿主细胞的运载工具，是分子克隆技术不可或缺的重要组成部分，其中，质粒是最常用的载体。面对日益繁多的质粒，正确阅读质粒图谱是进行分子克隆的前提。本文将介绍如何阅读质粒图谱。

一、质粒的概念及分类

1.概念

      质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1-300 kb。

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足基因工程载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建，所以目前使用的质粒多为人工改造的质粒。

理想的质粒应满足以下条件：

①复制能力：具有独立的复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增；

②表达能力：作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因； 

③稳定性高：细胞内能持续复制和表达；

④酶切位点：具有适当的限制性核酸内切酶识别和切割位点，即外源基因插入部位；

⑤遗传标记：便于重组体的筛选和鉴定；

⑥分子量小：以容纳较大的外源基因。

2.分类

（1）按功能分类:克隆载体、表达载体

       克隆载体（cloning vector）：具有克隆载体的基本元件（复制起始位点,抗性基因,多克隆位点等)，可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和扩增DNA片段或基因的载体。

表达载体（expression vector）：除了具有克隆载体的基本元件外，还有可以表达调控目的基因的元件，即转录翻译所必需的DNA序列。

（2）按受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体和穿梭载体

       原核载体（prokaryotic vector）：能在原核细胞中复制和表达的载体真核载体（eukaryotic vector）：能在真核细胞中复制和表达的载体

穿梭载体（shuttle vector）也叫转移载体（transfer vector），指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保能够在原核和真核两种宿主细胞中复制与扩增，并可以在真核细胞中有效表达。

二、质粒的基本元件

1.复制起点（Origin of replication，ori）

       DNA复制起始位点ori负责控制质粒复制的起始，原核生物DNA分子中只有一个复制起始位点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒；而图谱上有两个ori，则表示该质粒是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。

2.启动子（promoter, P）

       与RNA聚合酶特异性结合，促进基因转录的DNA序列。含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

真核细胞含有三类RNA聚合酶，因此真核启动子还分为I、II、III类启动。常见表达或者过表达都是II类启动子，而III类启动子如U6、H1，启动小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于构建shRNA和sgRNA载体进行敲低或敲除操作。

Ⅱ型启动子在使用特点上又可分为三大类：组成型启动子（广泛性启动子）、组织特异性启动子、诱导型启动子。

此外，不同物种的表达体系具有不同的启动子，启动子启动基因表达也有强弱之分，因此我们需要根据自己的需求选择含有相应启动子的质粒。关于启动子的详细介绍见往期推文。

3.增强子（enhancer）：增强目的基因转录

4.筛选标记（selectable markers）

       多为抗生素抗性基因，方便后续筛选阳性克隆。原核细胞筛选标记常用的是氨苄青霉素/氨苄西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四环素Tet等；真核细胞筛选标记用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。质粒图谱中用抗生素缩写+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

抗生素作用机制及用途见下表

5. 多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）

       外源 DNA的插入位点，通常位于启动子的下游，具有多个核酸内切酶的酶切位点，可通过酶切/连接方式将外源 DNA 插入到质粒。质粒图谱中有些酶切位点右上角标注了“*”，代表可能并不仅仅存在单一限制位点，所以一般不选用标有星号的酶切位点。

6.转录终止信号（polyA  signal）

       转录到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA会接上polyA并转录终止。常见的转录终止信号位SV40 polyA，简写为SV40 pA

7. 荧光基因

      可以用激光激发产生荧光的蛋白，一般会独立表达或和目的基因融合表达的方式被设计在质粒上，起到示踪、阳性检测、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白标签

      蛋白标签大多为较短的短肽，一般融合表达在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了标签，在缺乏针对目的蛋白的抗体时就可以很方便的对目的蛋白做检测了

9.其他调控元件

WPRE：来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件，放置在目的基因的上游，能加强目的基因的表达。

cPPT：来自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度。

三、如何阅读质粒图谱

以pLKO.1-Puro质粒（常用于构建shRNA载体）为例，对质粒图谱进行解读

1.首先看箭头方向

      质粒图谱上都会存在箭头，箭头方向可以代表转录方向如图中U6、hPGK、AmpR等启动子（白色箭头）的方向，也可以代表复制方向，即 ori（黄色箭头）的箭头方向。设计引物及插入目的基因的方向是根据转录方向（启动子方向）来定的。由于质粒是环状双链DNA，箭头可有顺时针和逆时针方向，代表两条DNA链，它的启动子在其中一条链上，而它的某些基因在另一条链上。

2.看ori鉴别质粒类型

      前文提到，若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒；而图谱上有3个ori，则表示该质粒是穿梭质粒。因此该质粒为穿梭质粒。

3.看启动子确定质粒的作用

       该质粒图谱中有7个启动子（白色箭头），U6启动子可用于构建shRNA和sgRNA载体；hPGK和AmpR启动子启动Puro和Amp抗性基因的表达，可用于筛选阳性克隆。T3和T7启动子分别是噬菌体T3和T7 RNA聚合酶的启动子，lac启动子是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子，RSV启动子是rous肉瘤病毒增强子/启动子。

4.看筛选标记/抗性基因

       图中有AmpR（氨苄西林抗性基因）和PuroR（嘌呤霉素抗性基因），AmpR用于原核细胞如大肠杆菌筛选，PuroR用于真核细胞如肿瘤细胞的筛选。当大肠杆菌和肿瘤细胞中不存在该质粒时就无法表达抗性基因，因此应用氨苄西林或嘌呤霉素可以筛选出阳性克隆。各抗生素作用机制与用途见前文。

5.看多克隆位点

       该质粒图谱中圆圈外围的黑体字母代表酶切位点，可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro质粒常用于构建shRNA载体，插入的shRNA靶序列位于U6启动子下游且紧邻U6启动子。针对该质粒，我们常选用AgeI和EcoRI这两个酶切位点引入外源shRNA靶序列。

6.看转录终止信号

       质粒图谱中pA或者poly A代表转录终止信号。

7.荧光标记

      有的质粒带有荧光标记，用于直观判断质粒是否转染成功。如下图所示，与pLKO.1-Puro相比，pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV启动子/增强子和EGFP序列（箭头表示），CMV启动子启动EGFP（增强的绿色荧光蛋白）的表达。其余部分与pLKO.1-Puro相差不大。

8.其他

        回到pLKO.1-Puro质粒，长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）存在于反转录病毒基因组的两端，即5’ LTR和3’LTR，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件。

cPPT来自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度。

M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物，可用于后续测序。

CAP binding site（CAP结合位点）在cAMP存在时激活转录。

HIV-1Ψ是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包装信号。 

RRE（Rev response element）允许Rev依赖的mRNA从细胞核输出到细胞质。

gp41 peptide介导HIV与CD4细胞融合，从而HIV进入细胞内。

想必通过上面的讲解，大家对质粒图谱的阅读应该有大致的了解，那就找几张质粒图谱练习吧。可在addgene网站（https://www.addgene.org/）搜索想要的质粒。如图：

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