细胞系的培养与传代实验指南
细胞系的培养与传代
简介（INTRODUCTION）
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
材料（MATERIALS）
o 试剂（REAGENTS）
完全培养基（RPML1640或DMEM），胰蛋白酶消化液,1XPBS
o 试剂准备（REAGENT SETUP）
1XPBS:NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml；双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L,高温灭菌后4℃保存,也可配制10XPBS室温保存；
完全培养基：90%液体培养基+10%小牛血清（特殊需要会标注在培养基说明书上）；
胰蛋白酶消化液：0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA加入1XPBS，终体积为100ml，pH7.4，0.22um滤过除菌分装，4℃保存。
o 器械（EQUIPMENT）
EP管、15ml离心管、离心机、细胞培养箱
实验步骤（PROCEDURE）
贴壁细胞传代与培养 ►预期时间消耗：30min
1. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，并将培养基与PBS置于37℃水浴，
胰酶消化液室温放置，点燃酒精灯，将所需试剂摆放到相应位置；
2．用1ml枪头弃去培养皿中上清液，加入3ml 1XPBS洗涤两遍，加入胰酶消化液1ml，轻轻摇晃后放于细胞培养箱中1min（可酌情增加时长），可以放在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆即可；
3．加入6ml培养基并吹打培养皿底，将细胞移入离心管中，1000rpm 3min离心；
4．弃上清，加入1ml培养基吹打均匀，用细胞计数板计数后取需要的细胞数量加入到新的培养基中，摇晃均匀；
5．放置培养箱中培养，可以每天观察，期间如果细胞培养基营养不够可更换成新鲜培养基。
▲关键步骤：控制好消化时间，有些贴壁细胞贴壁较紧，需要确保吹打均匀。
悬浮细胞传代与培养 ►预期时间消耗：30min
1．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，并将培养基与PBS置于37℃水浴，胰酶消化液室温放置
2．点燃酒精灯，将所需试剂摆放到相应位置
3．将培养皿中培养基移入15ml离心管中，800rpm离心5min
4．弃上清，用2ml 1XPBS洗涤两次，每次800rpm离心5min
5．加入1ml完全培养基，细胞计数后取需要的细胞数量加入到新的培养基中，摇晃均匀
▲关键步骤：吹打细胞需要轻柔，并且混合均匀。
针对性建议（TROUBLESHOOTING）
细胞培养条件会根据不同细胞要求不同，以下是总结的条件：
1. 293：人肾上皮细胞， 10%FBS DMEM，从培养皿板底吹下传代；
2. BHK‐21：幼地鼠肾细胞， 10%FBS DMEM，胰酶消化传代；
3. NK92：人的 NK 细胞系（悬浮细胞系）， 12.5%FBS +12.5%horseserum α‐mem， 100U/ml 的 IL‐2；
4. MCF‐7：人乳腺癌细胞， 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
5. L929： 1:3 传代，扩大培养去上清。长满后取走上清，换新鲜培养基，过 2,3 天可以取用，一共可以取两批；
6. HT‐29：结肠癌细胞。 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
7. 293T： 10%FBS DMEM，从培养皿板底吹下传代；
8. DC2.4： 10%FBS DMEM，胰酶消化传代；
9. Hela: 人宫颈癌细胞。 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代。 2ml 长三天满；
10. Thp1: 10%FBS 1640 培养， 3 天一代，细胞长过影响状态，小瓶留 2ml 传代，大瓶留 7ml 传代；
11. HepG2:人肝癌细胞系。 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
12. LO2: 正常 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
13. Huh 7: 人肝癌细胞系。 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
14. Hepa1‐6(mice liver cancer cells): 10%FBS DMEM， PBS 冲洗两次胰酶消化传代；
15. NCTC 1149(mice liver cells): 10% horse serum DMEM， PBS 冲洗。
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产品详情
产品名称
货号
规格
目录价格
特级胎牛血清
FBS-P500
500ML
6000
特级胎牛血清
FBS-P100
100ML
1200
描述：
内毒素含量极低 <5EU/ml(国际规定：特级胎牛血清<10 EU/ml)
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建议使用范围：
科研使用; 细胞培养
推荐血清融化方法：
操作
温度
100ml
500ml
1000ml
第一步
室温
35 min
90 min
100 min
15—20℃水浴
5 min
18 min
20 min
第二步
20℃水浴
15 min
25 min
30 min
第三步
37℃水浴
20 min
35 min
45 min
注意：
♦ 在水浴过程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化过程中要慢慢摇动，使血清混匀，但不要产生泡沫!
♦胎牛血清不推荐热灭活。
储存：
-20°C冻存，4°C保存不超过1个月。反复冻融会破坏血清中有效成分，影响血清品质。
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