钙离子载体/探针（Calcium Ionophores/Indicators）—————专题

    钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此，钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。

钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。

钙离子浓度变化是活细胞接受外界刺激后产生级联反应的重要信息传递方式，因此细胞内钙离子检测是信号转导G蛋白偶联受体（GPCR）介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段，该领域中常使用钙离子荧光探针与钙离子的特异性结合来观察细胞内钙离子浓度水平的变化，此类探针未结合Ca2+前几乎无荧光，结合Ca2+后，荧光强度显著增强，所显示光谱可被荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱法以及荧光酶标仪等多种方法检测。

细胞内钙离子浓度的变化能触发细胞凋亡，下述两款钙离子荧光染料被广泛使用，它们具有细胞透性，因此可以染活细胞。它们与钙离子结合后荧光强度大大提高，可用于流式细胞术、免疫荧光和荧光色谱分析。

 FURA-2是细胞内钙离子（Ca2+）的特异性荧光指示剂，由Grynkiewicz等于1985年合成。它能特异性地与Ca2+结合，结合比例为1:1同时发出荧光，结合Ca2+后的最大激发波长从结合前的380nm移向340nm，其发射荧光强度与结合Ca2+的浓度有定量关系。由于FURA-2是极性大的酸性化合物，无法进入细胞内，为此在其负性基团上结合了乙酰氧甲酯，使其成为FURA-2-AM．既增加了酯溶性又消除了负电荷，使之容易进入细胞内，在细胞内被酯酶水解成FURA-2后可与胞浆游离Ca2+可逆性结合。但FURA-2-AM在细胞外并不能与Ca2+结合，所以检测的340nm激发下的发射荧光强度可定量的确定胞内Ca2+浓度及其动态变化。

一. FURA-2

Fura-2是由紫外光激发的，一般用340nm以及380nm处激发它产生的荧光比值（510 nm处检测）表示钙离子的浓度。

        FURA-2的特点

        1) 荧光强度大，敏感度高，且所用剂量小，对细胞内环境影响小；

        2) FURA-2测定[Ca2+]基本不受细胞密度及荧光剂浓度的影响，易于识别与计算；

        3) 对钙的选择性高；

        4) 自身荧光小；

        5) FURA-2与Ca2+结合的解离常数(Kd) 37℃为224，其标准曲线具有良好的线性，其对Ca2+的测定范围为10-5～10-82 mol/l，且能测定短暂而快速的Ca浓度的变化。

FURA-2的应用：它主要应用于两个方面，一是将FURA-2直接注入单个细胞内，用荧光显微镜观测Ca2+染色；二是测定细胞悬液、组织块或贴壁细胞的细胞内Ca2+浓度。

左图：REF-52成纤维细胞用FlCRhR处理后，用FURA-2染色。第一行显示cAMP变化，第二行FURA-2染色显示CA2+变化。1-4列分别为对照、处理0分钟、17分钟和38分钟的荧光图象。结果显示，胞内cAMP诱导的FICRhR C亚基增多（FITC标记），但Ca2+浓度变化不大。该文章发表在Proc Natl Acad Sci USA 93, 4577(1996)。

二.Fluo-4 

Fluo-4 是一种将Fluo-3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度比Fluo-3强1倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似(Fluo-3: Kd=0.4 umol/l、Fluo-4: Kd=0.36 umol/l)，所以使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4-AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。

上图是以9秒间隔连续拍摄而成。该细胞首先用50 mM KCl去极化处理 (2)，然后用离子载体ionomycin 5 uM处理 (8)。该照片由荧光显微镜成像，再由冷CCD拍照而成。后期处理将浓度差异转化为颜色差异，红色表示高浓度钙离子，蓝色表示低浓度钙离子。

常用的Ca2+荧光探针根据波长的不同，分为两大类：

第一类：可见光激发Ca2+荧光探针

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低了对活细胞的光毒性。

3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。5）无光谱偏移。

介绍几种最受欢迎的可见光激发Ca²⁺荧光探针：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可见光激发Ca²⁺荧光探针，较高的Ca²⁺结合力可捕捉细胞内Ca²⁺信号的动力学变化，使用于多种流式细胞术相关实验，如笼锁Ca²⁺螯合剂光活化、第二信使、神经传导物质研究以及细胞水平的药物筛选等。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至100倍，最大激发波长为 506nm，最大发射波长为 526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

2）Fluo-4

Fluo-4是钙指示剂Fluo-3的升级版本，主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4上的氟所取代，该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快，在相同浓度下检测信号更强。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一种可见光激发的高亲和力Ca²⁺指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁Ca²⁺螯合剂光激活导致的钙离子释放。

图 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 µM free Ca²⁺.

你所不知道的秘密：为什么许多荧光探针会有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM为例。

常规的荧光探针如Fluo-4属极性大的酸性化合物，无法进入细胞内。此时，若想做细胞内染色，需要通过膜片微电极（patch pipette），显微注射（microinjection），胞引作用加载试剂等手段，辅助实现药物加载，何其麻烦！！

为此，而通过在Fluo-4的负性基团上结合乙酰氧甲酯（AM），该单一的变化既增加了酯溶性又消除了负电荷，极大的提高了细胞渗透性。只需要把细胞孵育在含药物的培养液中，即可实现加载，非常省事。而一旦Fluo-4 AM进入细胞后，酯化钙离子荧光探针被酯酶水解，恢复Fluo-4，在胞内完全发挥其正常生理功能。

第二类：紫外光激发Ca²⁺荧光探针

Fura-2和Indo-1均属可见光激发Ca²⁺荧光指示剂，也是目前最常用的比率测量荧光探针。与第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1发出更强的荧光，在生理pH范围内对pH变化不敏感。与Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子相比，对Ca²⁺有更高的选择性，因此得到了广泛应用，同时作为双波长荧光染料在标定Ca²⁺浓度时不再单纯依靠荧光强度的变化。

1）Fura-2

2）Indo-1

Fura-2是双激发波长荧光染料，Indo-1是双发射波长荧光染料，均采用比率测量方法，该方法可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。Fura-2特别适合于数字成像显微镜，使用该设备可更方便的调整激发波长，使探针结合钙离子后在300-400nm的激发波长范围内扫描Fura-2的吸收偏移，在510nm处检测发射波长。相比之下，Indo-1更倾向于流式细胞术检测，使用该设备可实现在氩离子激光器的351-364光谱范围内单一波长的激发，在400nm和480nm的波长处分别检测结合钙离子和未结合钙离子的荧光信号，通过二者的比值确定钙离子的浓度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分别是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活细膜渗透性。

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