抗性淀粉检测试剂盒(分光光度法50T/48S）
| 货号 | SH0634 | 售价（元） | 1800 |
| 规格 | 50T/48S | CAS号 |
- 产品简介
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货号 |
名称 |
规格 |
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SH0634 |
抗性淀粉检测试剂盒(分光光度法50T/48S） |
50T |
抗性淀粉（RS）是指在人小肠内不能被酶解的淀粉，在大肠部分或完全发酵。RS是总膳食纤维的组分之一。
抗性淀粉的测定方法： 样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振荡水浴孵育16小时，在这期间，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS,变性乙醇）终止反应。离心上述溶液，收集上清勿弃，底部残留絮状团即为样品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复一次洗涤离心，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定可通过集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。
应用性和精确性
这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w，如RS含量多于2% w/w，常规标准误差为±5%，少于2% w/w RS的误差更高。
试剂盒组成与配制
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试剂名称 |
储存条件 |
SH0634-50T |
注意事项 |
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试剂一 |
-20℃ |
粉剂mg×1瓶 |
用前甩几下使试剂落入底部，再加5ml的醋酸钠缓冲液（100mM pH4.5）涡旋溶解，可分为适当大小的等分试样，并在使用期间储存在-10℃以下的聚丙烯管中，避免反复冻融，如有可能，在使用过程中保持冷却。（未配制时在-20℃稳定2年以上，配制使用后在-20℃稳定1~3个月） |
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试剂二 |
-20℃ |
粉剂g×5g |
用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM，pH6.0)悬浮1g试剂二中的产品，搅拌5分钟。加入1.0mL稀释后试剂一（过程见：溶液/悬浮液的制备），混匀，>1500g离心10分钟，慢慢倒出上清液，这就是制备的试剂二。（试剂二制备后应当天使用） 注：可根据实验过程中的使用量适量配制 |
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试剂三 |
4℃ |
粉剂g×1瓶 |
用之前加450ml蒸馏水溶解混匀，后用2M氢氧化钾调节至pH7.4，最后用蒸馏水定容至500ml，即为试剂三。 |
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试剂四 |
-20℃ |
粉剂 mg×1瓶 |
用20mL试剂三缓冲液溶解试剂四中的内容物，并将其定量转移到含有剩余试剂三缓冲液的瓶子中。用铝箔盖住这个瓶子，以保护密封的试剂不受光照，此试剂为 GOPOD试剂。（未配制时在2-5℃或＜-10℃下存放超过12个月，配制使用后在2-5℃或＜-20℃可稳定1~3个月） 备注：如果该试剂要以冷冻状态储存，则最好将其分装为小份，在使用过程中仅冷冻/解冻一次。 新制备试剂，其颜色为浅黄色或浅粉色。在2-3个月后，若该溶液将呈现出更强烈的粉红色应立即对照蒸馏水读数，吸光度应小于0.05，若大于此数值，则表示该溶液不可再使用。 |
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标准品 |
4℃ |
液体5mL×1瓶 |
D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL） |
溶液/悬浮液的制备
试剂一的稀释：使用移液枪吸取2 mL试剂一溶液用顺丁烯二酸钠缓冲液（100mM pH6.0）稀释至22mL。
注意：以5 mL为单位分装后-20℃保存，反复冻融会影响其稳定性。
溶液配制
1. 顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)含2mM二水合CaCl2和0.02%叠氮化钠（防腐剂，若没有该试剂可不添加）：用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸钠，接着用NaOH调节pH至6.0，加入0.6g二水合CaCl2和0.4g叠氮化钠，混合并溶解，定容至2L。
2. 醋酸钠缓冲液（1.2M，PH3.8）：将69.6mL的冰醋酸加至800 mL的蒸馏水中，用NaOH调节pH至pH3.8，用蒸馏水定容至1L。
3. 醋酸钠缓冲液（100mM，PH4.5）：将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中，用NaOH调节pH至4.5，用蒸馏水定容至1L。
4. 氢氧化钾溶液（2M）：将112.2g KOH加至900 mL的去离子水中，搅拌溶解。定容至1L，密封保存。
5. 50%乙醇：将500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）加入500mL的水中，密封保存。
仪器设备
1. 离心式粉碎机，带有齿轮转子和1.0mm筛子，或类似的装置；小型样品可选择磨碎机替代。
2. 绞肉机-手动或电动的，装有4.5mm筛
3. 台式离心机
4. 振荡水浴器，可设定为每分钟100次直线运动（振荡速度为每分钟200里程），振荡距离35mm,37℃
5. 水浴锅
6. 涡旋仪
7. 磁力搅拌器
8. 磁力搅拌棒-5×15mm
9. pH计
10. 计时器
11. 分析天平（精确到0.1mg）
12. 分光光度计-能够设定510nm（10mm路径长度）
13. 100μL移液器及一次性枪头
14. 连续分配器配有50mL管嘴，能够移取2.0mL，3.0mL和4.0mL
15. 温度计-能够读取37+0.1℃和50+0.1℃
16. 容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L
样品制备
用磨碎机研磨大约50g谷物样品或冻干植物或食品，使样品粉末可过1.0mm筛，转移所有的材料至广口瓶，颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨，用绞肉机粉碎鲜样（如罐装的豆子，香蕉，土豆），过4.5mm筛，测定干样中的含水量，根据AOAC法925.10，冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。
分析方法
（a）水解和溶液化非抗性淀粉
1. 准确称取100mg样品后直接倒入15mL离心管中，样品应尽量集中在底部，向每个离心管中加入4.0 mL试剂二；
注意：对于湿样，样品大概为0.5g（准确称重），这些材料的含水量通常为60-80%
2. 盖紧离心管管盖，进行涡旋混匀，之后放入振荡水浴器中37℃孵育16h；
3. 把离心管从水浴锅中拿出，用纸巾擦掉多余的水，打开盖子放置在涡旋仪上轻轻涡旋同时加入4.0mL无水乙醇混匀；
4. 1500xg离心10min，小心倒出上清并保留（后续实验及计算需要），向沉淀中加入2mL 50%乙醇，用涡旋仪涡旋混匀，再加入6mL 50%乙醇，涡旋混匀；
5. 1500xg离心10min，小心倒出上清并保留（后续实验及计算需要），重复上述重悬浮步骤；
6. 1500xg离心10min，小心倒出上清并保留（后续实验及计算需要），翻转试管，用纸巾吸除多余的液体。
（b）测定抗性淀粉含量
1. 将离心管放入冰上进行冰浴，向每个离心管中加入2 mL 2M的KOH再使用磁力搅拌棒搅匀，用磁力搅拌棒在冰浴状态下搅拌20min，使抗性淀粉得到充分溶解；
注意：
（1）不要使用涡旋仪混匀，会导致淀粉乳化。
（2）确保边加入KOH溶液边搅拌，避免形成难溶的淀粉块。
2. 向每个离心管中加入8 mL醋酸钠缓冲液（1.2M，pH3.8），使用磁力搅拌机搅拌，混合均匀后加入0.1mL试剂一，混匀，放入水浴锅中50℃水浴30min，期间用涡旋仪混匀3~5次；
3. 对于抗性淀粉含量>10%的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶并用蒸馏水定容至100mL，混匀后，1500xg离心10min（对于抗性淀粉含量<10%的样品，直接1500xg离心10min）；取上清液，即为抗性淀粉上清液；
4. 吸取步骤4抗性淀粉上清液0.1mL至5mL EP管中，一式两份，分别加入3.0mL的试剂四溶液，50℃孵育20min;
5. 测量每一个溶液在510nm处相对于空白试剂的吸光度值；
注意：反应结束后，放冷5min内测完结果
6. 计算抗性淀粉的含量。
（c）计算可溶性的非抗性淀粉含量
1. 将流程（a）中步骤4~6的上清收集到容量瓶中，用醋酸钠缓冲液（100mM，pH4.5）定容至100mL，混匀作为非抗性淀粉待测液；
2. 使用移液枪吸取0.1 mL非抗性淀粉待测液转移到5mL EP管中（一式两份）并加入10μL稀释试剂一混合均匀，50℃孵育20min，之后加入3.0 mL试剂四溶液混合均匀，50℃孵育20min；
3. 计算在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。
注意：反应结束后，放冷5min内测完结果；
4. 计算非抗性淀粉的含量。
（d）制备空白试剂和标准品溶液
1、准备空白试剂：将 0.1ml 的醋酸钠缓冲液（100mM，pH4.5）和 3.0ml 的试剂四溶液混匀；
2、制备标准品溶液（一式四份）：将 0.1ml 标准品和 3.0ml 的 试剂四溶液混匀；
3、统一放入50℃孵育20min，记录在510nm下的吸光度值。