产品信息

 1.产品概述

免疫共沉淀Co-IP（Co-Immunoprecipitation）是基于抗体和抗原之间结合的专一性用于研究蛋白质相互作用的经典方法。其原理是细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的蛋白质与蛋白质相互作用体被保留下来，然后利用目标蛋白质特异性抗体进行免疫沉淀。沉淀得到的蛋白质复合体能够通过变性凝胶电泳分离开来，以此定性或定量分析几种蛋白质间相互作用。

2.试剂

3.材料

 Poly Mac Tips  35个

4.实验步骤

1. 蛋白提取

1) 细胞样本

1 洗涤：预冷的 1 ml  1×PBS 洗涤样品（约 1×10⁷个细胞）2 次，最后一次吸干 1×PBS；

2 裂解：根据细胞量加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30 min，期间颠倒混匀 3 次，再超声3次，每次5 sec。

3 离心：4℃，13000 g，15 min，收集上清；

4 测BCA，将收集的上清用Cell lysis buffer稀释到1ug/ul。

2) 组织样本

1 研磨：取新鲜组织或深低温组织（不少于 0.3g），置于研钵中，用液氮进行研磨，转移组织粉末至新的 EP 管中；

2 裂解：加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30min，期间颠倒混匀 3 次；

3 离心：4℃，13000 g，15 min，收集上清。

4 测BCA，将收集的上清用Cell lysis buffer稀释到1ug/ul。

2.蛋白与抗体孵育

1 将步骤 1 得到的样品，取 100 μL 作为 Input 组，取 900 μL 作为 IP 组，Input 组-80℃保存待用，IP 组管加入 2~5 μg 目的抗体；

2 4℃，垂直混匀器摇动孵育过夜。

（一般每个IP样本需200-500μl细胞裂解物，浓度在1μg/μL左右，以下步骤以200μl细胞裂解物进行IP为例）

3. Protein-A/G 磁珠悬液准备

1 取 20 ul Protein A/G-Beads，4℃，瞬离弃上清；

2 加入 500 ul 预冷的Cell lysis buffer，混匀，瞬离弃上清，再重复洗涤 1 次；

3 用 100 ul 预冷的Cell lysis buffer 将 Protein A/G-Beads 配成悬液。

4. Protein-A/G 磁珠与抗体结合

1 取步骤 3 得到的 100 μL Protein A/G-Beads 悬浮液加入到 IP 组 EP 管中，4℃，垂直混匀器摇动 2~3 h；

5.洗涤、洗脱

1 将步骤 4 的 IP 组样品，转入 Poly Mac Tips中,500rpm,60 ses；

2 加入200ul Wash buffer I 转IP样品于 Poly Mac Tips中（尽量多的将IP样品残留转移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重复洗涤1次。

3 用 200ul Wash buffer II 转IP样品于 Poly Mac Tips中（尽量多的将IP样品残留转移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重复洗涤1次；

4 弃过滤液，标记新的EP管待用，加入100 ul Elution buffer,500 rpm,40 sec。

5 在收集的样品中加入10 ul Neutralization buffer。

6 重复4、5步骤，收集220ul样品，残余用注射器吹入EP管，涡匀离心，-80℃保存待用。

5. 质谱检测（选择一）

6. western blot（选择二）

8.注意事项

本产品Protease inhibitor 对人体有毒，操作时要特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内；

本产品仅限于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

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