产品信息

产品简介

亲脂性荧光染料PKH67(Green)和PKH26(Red) 适用于常规细胞膜标记。荧光染料PKH67 是⼀种可对体外和体内细胞示踪的绿色荧光染料，通过与膜结构的脂质分⼦结合⽽标记细胞。PKH67对细胞毒性较⼩，荧光背景低，脂溶性⾼，能够轻易穿透细胞膜，有着强⽽稳定的绿⾊荧光。经PKH67标记的细胞可⽤于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染⾊的功能。在细胞分裂增殖过程中，PKH67 的荧光强度会随着细胞的分裂⽽逐级递减，标记荧光可平均分配⾄两个⼦代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的⼀半，根据这⼀特性，它可被⽤于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等⽅⾯。PKH67标记细胞的荧光⾮常均⼀，并且分裂后的⼦代细胞的荧光分配也更均⼀。在细胞分裂增殖过程中，PKH67标记荧光可平均分配⾄两个⼦代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的⼀半，通过流式细胞仪根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂⼀次(1/2 的荧光强度)，⼆次(1/4 的荧光强度)，三次(1/8的荧光强度)，以及更多分裂次数的细胞。PKH67 可检测分裂次数多达六次甚⾄更多。除了⽤于细胞增殖检测，PKH67 还可以⽤于细胞的体外盒体内⽰踪，标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注⼊体内，可以有效的显⽰移植细胞在活体组织中的迁移及分化。PKH67标记的细胞⽤于体内观察可以长达数周之久，它常被⽤来做活体细胞检测实验和⽤荧光电镜观察细胞长期活动的实验。PKH67 毒性较⼩，不影响细胞的增殖能⼒。此⽅法操作简单，且不⽤放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

由于炭尾长度更长，内部研究已经证明PKH67比PKH2由更少的细胞间转移。在采用PKH1和PKH2进行的体内研究中，荧光强度都会缓慢损失。由于这是绿色细胞linker染料而非红色细胞linker染料出现的行为特征，因而PKH67会出现类似的性质。不分裂细胞的体外细胞膜留存和体内荧光半衰期的关联性揭示，PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。其他具有类似半衰期的绿色细胞linker染料已经被用于监测1-2月内的体内 淋巴细胞和巨噬细胞运输，结果表明PKH67还可用于中等时长的体内跟踪研究。

染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。PKH67标记细胞后通常⽤流式细胞仪进⾏细胞增殖检测。

试剂盒组分

PKH67标记细胞呈绿⾊荧光，荧光波长：λex=490 nm,  λem=502 nm。

实验步骤

1．染色液制备：

（1）从冰箱中取出PKH67试剂，静置⼏分钟⾄室温，或者37℃⽔浴⽚刻后，离⼼盛放PKH67 的管⼦，开盖前请务必离⼼⼏分钟让试剂充分落⼊管底后才能开盖。

（2）根据需要检测的细胞样品数，⽤稀释液将探针10倍稀释，再⽤合适的溶液(如：⽆⾎清培养基，HBSS或PBS)将PKH67母液25倍稀释，配制成染⾊⼯作液。最佳⼯作液浓度请根据不同细胞和⾃⾝的实验体系来调整。⼀般细胞使⽤按试剂盒中的母液的终浓度250倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。

2. 细胞染色

（1）将制备好的待测细胞⽤100μl染⾊⼯作液重悬，⾄细胞浓度⼤约107/ml。也可以进⾏原位染⾊，染⾊液⾜够覆盖细胞即可。

（2）在2～8 ℃培养细胞 15～30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。

建议待标记细胞在染⾊⼯作液中于37℃孵育5min，再于4℃孵育15min。

低温孵育可降低细胞对染料的内吞作⽤，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。

（3）离⼼后去上清，收集细胞，⽤PBS或⽆⾎清培养基洗涤细胞1-2次，最后加⼊PBS或⽆⾎清培养基重悬细胞。

（4）取500μl 细胞悬液，⽤流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502nm。

（5）随后还可按照细胞的正常培养⽅法进⾏培养。

（6）可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再⽤流式细胞仪检测细胞增殖，或⽤于其他特定实验⽬的的细胞荧光⽰踪。

储存条件：-20℃避光保存有效期1年

注意事项：

1.染⾊浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少⽽异。

2.配制的PKH67母液极易⽔解，建议分装保存， ≦-20℃冷冻干燥保存。

3.PKH67 ⼯作液应现配现⽤，不能提前配制，因为PKH67 吸⽔会分解，影响染⾊效果。

4.PKH67 易被⽔解，在⽔溶液中会很快变质。母液请在使⽤过程中避免接触⽔。⼯作液在标记细胞的过程5.中和⽔接触是在许可的时间范围内的。

6.PKH67荧光染⾊剂为乙醇溶液，在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固⽽粘在离⼼管管底、管壁或管盖内，7.从冰箱取出后恢复⾄室温，变成液体状态后离⼼⾄管底部再开盖。可以37℃⽔浴⽚刻⾄全部融解后使⽤。

8.不同的细胞种类标记后可以⽰踪的代次或时间差异较⼤，请根据实际情况或参考⽂献进⾏检测。

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