Fluo-4, AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-4，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

Fluo-4是可见光激发波长Ca2+荧光探针Fluo-3的改良版本，通过将Fluo-3结构上的氯离子（Cl-）替换为电子吸引力更强的氟离子（F-），使得最大激发波长往短波长偏移10nm左右。正由于这个波长更接近氩激光器的波长，则当使用氩激光器来激发探针Fluo-4，能够得到更强的荧光强度，比Fluo-3强一倍。另外，Fluo-4的Ca2+亲和力几乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上几乎同Fluo-3。Ca2+结合后的最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可通过激光共聚焦显微镜或流式细胞仪来检测胞内钙离子水平的变化。

可见光激发Ca2+荧光探针的优势：

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2） 具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低对活细胞的光毒性。

3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。

6）无光谱偏移。

Fluo-4, AM相比较于Fluo-3的优势：

1）激发和发射波长往短波长偏移10nm，更接近氩激光器的波长，。因此，当使用488nm进行荧光激发，得到更强的荧光信号，比Fluo-3强一倍。

2）50μg小包装供应，使用方便，且能很好保证产品的稳定性。

可见光激发Ca2+荧光探针的优势：

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2） 具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化，从而降低对活细胞的光毒性。

3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。

6）无光谱偏移。

Fluo-4, AM相比较于Fluo-3的优势：

1）激发和发射波长往短波长偏移10nm，更接近氩激光器的波长，。因此，当使用488nm进行荧光激发，得到更强的荧光信号，比Fluo-3强一倍。

2）50μg小包装供应，使用方便，且能很好保证产品的稳定性。

产品性质

CAS 号（CAS NO.）:273221-67-3

分子式（Molecular Fomular）:C51H50F2N2O23

分子量（Molecular Weight）：1096.95

Ex/Em (nm)：494nm/516nm

纯度（Purity）：≥98%

外观（Appearance）:粉末

使用说明：

1. （可选）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末中加入0.5ml DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2. Hanks balanced salt solution（HBSS,不含Ca2+, Mg2+）

操作方法

1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入适量DMSO，配制成1-5mM的储存液，DMSO的加入量根据Fluo-4,AM（MW1096.95）分子量进行计算（如：若配制成1mM的母液，需向50ug Fluo-4,AM中加入45.6ul DMSO）。

【注】：溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS将Fluo-4,AM稀释成1-5μM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 ml浓度为4 μM工作液，用1 ml HBSS溶液稀释4 μl 1mM母液即可。

【注】：① 推荐该探针加载浓度在4-5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

② Fluo-4,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）（可选）如果Fluo-4进入细胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。

4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

5）将 Fluo-4, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养10-60min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。

【注】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30分钟，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

6）用HBSS溶液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

7）37℃培养箱孵育约 20-30 分钟，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

8）用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长 494 nm，发射波长 516 nm。

Fluo-4- AM  cell permeant

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）本Fluo-4,AM 容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）第一次使用时，建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

4）母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成5μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5）建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）保存条件：-20℃

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