阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种细胞增殖检测试剂，对各种人和哺乳动物细胞、细菌和真菌提供一种快速和敏感的细胞增殖和毒性检测方法。

阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种基于刃天青（resazurin）的检测试剂。刃天青作为一种一种氧化还原（REDOX）指示剂，根据细胞代谢还原情况发生颜色变化。氧化态的刃天青呈紫蓝色且基本无荧光，其还原态产物试卤灵（resorufin）转变为粉红色且高度荧光，产生的荧光强度与呼吸活细胞数量呈正比。通过检测呼吸过程中氧化水平，阿尔玛蓝用作一种定量检测细胞活力和毒性的直接指示剂。阿尔玛蓝的颜色变化可通过普通分光光度计检测吸光度变化，检测波长为570nm，参考波长为600nm；阿尔玛蓝的荧光变化可通过荧光光度计检测，激发波长在530~560nm之间，发射波长为590nm。

检测原理：（细胞增殖实验 Cell proliferation assay））

1.生长中细胞引起Alamar Blue的化学还原反应；

2. 持续性细胞生长维持还原环境，使得Alamar Blue呈红色，发强荧光；

3. 生长受抑制维持氧化环境，使得Alamar Blue呈蓝色，无荧光；

4. 使用基于荧光或吸光值检测的仪器收集数据；

5. 荧光检测的激发波长为530~560nm之间，发射波长为590nm；

6. 吸光值检测的波长为570nm，参考波长为600nm；

保存方法：

室温12个月稳定，2-8°C保存20个月稳定；避光保存；

产品优势：

简单：水溶性，只需添加和测量即可；

灵活：显色和荧光检测，悬浮细胞和贴壁细胞；

无毒：对细胞无毒，对使用者和环境也无毒；

可靠：大量引用用于细胞毒性和活力检测；

规模化：简单放大体系用于高通量分析

高灵敏：最低可检测到50个细胞

稳定高：独特缓冲配方使其能用于长期研究；

经济：不需要细胞裂解，使细胞能继续培养用于后续分析；操作时请注意避光。

注意事项

1. 还原态的Alamar Blue在水或水溶性缓冲液如PBS中很不稳定，但在培养基内非常稳定。为了确定特定实验还原态Alamar Blue的吸光度/荧光值，需准备100%还原态Alamar Blue试剂：将Alamar Blue与细胞培养基按照1:10的比例混合，高压灭菌15min即可。

2. 适宜的细胞密度能够增加检测灵敏度。对于96孔板，建议每孔接种100μl细胞，细胞浓度范围：贴壁细胞为100-10,000个/孔，悬浮细胞在2,000-50,000个/孔，以培养基为空白对照。对于384孔板，细胞浓度和接种量均减半。

3. 影响细胞对Alamar Blue反应的两大变量为孵育时间和铺板密度，建议实验前需先摸索优化这两个因素。细胞密度过高或孵育时间过长都会导致继发性还原反应，红色产物停止增加并开始衰减，导致吸光度/荧光水平明显下跌并伴随红色消失。

4. 微生物污染会还原Alamar Blue。因此对被污染细胞使用Alamar Blue检测会引起错误结果。

5. Alamar Blue可以用分光光度计或荧光计检测，但荧光灵敏度高，实验误差小，推荐荧光检测。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

一、制作标准曲线（测定最佳孵育时间和细胞数量）

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。注：设置阴性对照：细胞培养基中不加入细胞；阳性对照：100微升100%还原型Alamar Blue（不含细胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3. 放入细胞培养箱内培养（37℃,5% CO2）一定时间。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

5. 普通分光光度计在570 nm测定吸光度，参考波长600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 绘制标准曲线。以细胞数量或孵育时间为横坐标（X轴），Alamar Blue还原率为纵坐标（Y轴）。根据此标准曲线可以测定出适合的细胞数量或孵育时间（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致）。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。建议细胞数量为104/mL，具体每孔需要的细胞数量，需根据细胞类型决定。

2. 细胞中加入待检测药物，为检测药物对细胞增殖的作用，请设置合适的对照组，包括刺激细胞和非刺激细胞。

3. 混匀，放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）一段时间。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5. 放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）4-8 h，最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

7. 普通分光光度计在570nm测定吸光度，参考波长600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力计算                               

1.普通分光光度计检测

Alamar Blue还原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=117216；

A570=检测孔在570 nm波长的吸亮度；

A600=检测孔在600 nm波长的吸亮度；

E570′=还原型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=155677；

E600′=还原型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=14652；

C570=阴性对照孔在570 nm波长的吸亮度（培养基，Alamar Blue，无细胞）；

C600=阴性对照孔在600 nm波长的吸亮度（培养基，Alamar Blue，无细胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作为替代，则：

E540=氧化型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=34798；

E540′=还原型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=104395；

E630′=还原型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=5494；

2.荧光分光光度计检测

Alamar Blue还原率（％）= （实验组F590-阴性对照组F590）/（100%还原型阳性对照F590-阴性对照组F590）×100

F590=590 nm波长荧光值

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